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微生物对正十六烷的运输富集机理研究
1 引言
目前，生物修复被认为是最为经济有效的处理石油污染土壤的技术，主要依靠环境中的微生物以有机污染物为碳源进行新城代谢，从而净化土壤[1-2]。微生物细胞膜的功能之一是扩散屏障，即阻止碳氢化合物和亲脂性化合物向细胞内扩散[3]，但大量研究表明吸附在微生物细胞表面的烃类物质主要通过三种方式进入微生物体内，即被动运输，主动运输和整批转运[4]。Bateman 等[5]发现即使在细胞外基质中加入ATP 生成抑制剂，萘仍会顺利被转移到降解菌Pseudomona puidat 体内，因此认为萘通过简单扩散方式进入微生物体内。Shishido [6] 的研究结果表明，苯酚在浓度低于50 mg·L-1 时以主动运输方式进入降解菌体内，而在浓度较高时以被动运输的方式进入微生物细胞内。Kennedy[7]认为细菌直接吸附在油滴上然后烃类通过扩散或主动运输的方式进入菌株体内。Beal R[8]观察到接种量高时PG201 对正十六烷的降解率低于接种量低时十六烷的降解率，从而推测这一现象与正十六烷的运输方式有关。
Steinbuchel 和Ratledge[9-11]等人在研究中发现许多能降解烷烃类物质细菌在代谢过程中会产生不同的脂类物质，然后微生物将这些亲脂性物质以特定的形式储存在细胞内。文章在此基上，利用两种高效石油降解菌DQ01 和DQ02 为对象，研究吸附在微生物表面的正十六烷以何种方式进入微生物体内，以及细胞内烷烃的存在形式。
2 材料和方法
2.1 实验材料和仪器
无机盐培养基（MSM）：5%KH2PO4，0.1%NH4Cl，0.02%MgSO4 7H2O，0.0015%CaCl2，1mL 微量元素/L 培养基(每100mL 溶液包含0.5mg CuSO4·5H2O，1.0mg H3BO3，1.0mgMnSO4·5H2O, 7.0mg ZnSO4)，去离子水定容到1000mL，115℃湿热灭菌20min。
葡萄糖液体培养基：0.15%K2HPO4，0.02%MgSO4·7H2O，0.5%蛋白胨，1%葡萄糖，去离子水定容到1000mL，115℃湿热灭菌20min。
正十六烷培养基：在无机盐培养基中加入一定浓度的正十六烷。
仪器：Varian3800 气相色谱仪（美国瓦里安技术有限公司），THZ-C 恒温振荡器（哈尔滨东联公司），真空抽滤装置（北京康林科技），J-25 型高速离心机（美国BECKMAN公司），JY96-Π 超声波细胞粉碎机（宁波新芝公司），BX41 显微镜（OLYMPUS），120kVTecnai20 透射电子显微镜（FEI 香港有限公司），UV-240 紫外分光光度计（上海精密科学有限公司）。
2.2 实验方法
2.2.1 菌种对不同浓度正十六的运输富集试验
将微生物在温度为30℃的牛肉膏蛋白胨培养基中培养3d，然后4℃下储存。细胞从固体培养基中接种到液体培养基中，30℃下培养过夜。移取5mL 培养液以6000r/min 离心5min，过滤掉上清液后，剩下的菌体用5mL 灭菌的无机盐培养基（pH7.0）洗2 次，并以5mL 灭菌的无机盐培养基重悬，以10％的体积比接种到无机盐培养基中，加入一系列不同浓度（1、10、20、30、40、50、100 mg·L-1）的正十六烷，20min 后将培养液离心，菌体用无机盐培养基清洗1 次，乙醇/丁醇/氯仿（体积比为10/10/1）清洗细胞2 次，再用灭菌的无机盐培养基（pH7.0）洗2 次，以去除吸着在表面的烷烃。然后重悬于10mL 10mmol·L-1 的Tris-HCl(pH=7.5) 中，冰浴超声破壁，每次3s 共60 次，每次间隔7s， 离心分离(7000r/min,10min)，上清液用等体积正己烷超声萃取2 次。收集有机相，并用无水硫酸钠脱水，在旋转蒸发定容到1mL，用GC 测定浓度。富集的烷烃就是DQ01 和DQ02 体内烷烃的量。
2.2.2 菌种细胞内外正十六烷含量分析
这部分实验是为了分析烷烃从细胞外进入细胞内是顺浓度梯度还是逆浓度梯度。具体方法如下：微生物在温度为30℃的牛肉膏蛋白胨培养基中培养3d，然后4℃下储存。细胞从固体培养基中接种到液体培养基中，30℃下培养过夜。培养液以6000r/min 离心5min，然后菌体用5mL 灭菌的无机盐培养基（pH7.0）洗2 次，以灭菌的无机盐培养基重悬，以10％的体积比接种到一系列试管中，加入20 mg·L-1 十六烷，分别在1、2、5、10、15、20、30、40、60min 里将细菌离心，菌体用无机盐培养基清洗1 次，乙醇/丁醇/氯仿（体积比为10/10/1）清洗细胞2 次，再用灭菌的无机盐培养基（pH7.0）洗2 次，用GC 测定清洗溶液中的正十六烷，即为吸着在微生物表面的烷烃。细胞膜内烷烃富集量的分析见2.2.1。
2.2.3 NaN3 抑制条件下，菌种运输富集正十六烷的试验
微生物在温度为30℃的牛肉膏蛋白胨培养基中培养3d，从固体培养基中接种到液体培养基中，30℃下培养过夜。培养液以6000r/min 离心5min，然后菌体用5mL 灭菌的无机盐培养基（pH7.0）洗2 次，以灭菌的无机盐培养基重悬，以10％的体积比接种到正十六烷培养基（DQ01 和DQ02 中正十六烷的浓度分别为20 mg·L-1）中， 30℃，150r/min 培养25min，其中8.5min 后加入30 mmol·L-1 的NaN3，分别在1min，4min，5 min，8min，10min，14min，18min，25min 取出5mL 细菌离心，菌体用无机盐培养基清洗1 次，乙醇/丁醇/氯仿（体积比为10/10/1）清洗细胞2 次，再用灭菌的无机盐培养基（pH7.0）洗2 次，以去除吸着在表面的烷烃，收集清洗液，测定上清中正十六烷的浓度变化。然后重悬于10mL 10mmol·L-1 的Tris-HCl(pH=7.5) 中，冰浴超声破壁，每次3s 共60 次，每次间隔7s， 离心分离(7000r/min,10min)，上清液用等体积正己烷超声萃取2 次。收集有机相，并用无水硫酸钠脱水，在旋转蒸发定容到1mL，用GC 测定菌种体内的浓度。
2.2.4 超薄切片的制备和微生物体内包涵体的观察
参考 Preusting H [12]所用方法：将生长48h 的微生物离心后，倒去上清，2.5％戊二醛固定4h，PBS 缓冲液冲洗3 次，1％锇酸固定2h，PBS 缓冲液冲洗3 次。然后分别用30%、50%、70%、80％、90％、95％、100％乙醇脱水，每次15min。将环氧丙烷与EPON812 树脂按3?1 比例混合，放入样品，静置60min。将环氧丙烷与EPON812 树脂按1?1 比例混合，放入样品，静置60min。将环氧丙烷与EPON812 树脂按1?3 比例混合，放入样品，静置60min。将样品放入EPON812 树脂，静置60min。将样品用EPON812 树脂包埋剂进行包埋，60℃下放置24h。将聚合好的包埋块修块、超薄切片，然后醋酸双氧铀染色30min，柠檬酸铅染色30min，最后进行电镜观察。对电镜内细胞中包涵体物的情况进行分析。对照是用葡萄糖培养基培养的2 种菌种在培养48h 后用上面的步骤处理。
2.2.5 GC 条件
采用 Varian3800 气相色谱仪，色谱柱为HP-SE-54(30m，0.25mmid),载气（N2）流速为16-20cm/s，进样口分流比为60?1，进样口温度为250℃，FID 检测器温度为300℃，柱温100℃保持2min，并以10℃/min 升温到250℃保留10min。
3 结果与讨论
3.1 不同正十六烷浓度对菌种运输富集的影响
从图可看出，蜡状芽孢杆菌DQ01 和芽孢杆菌DQ02 体内富集正十六烷的含量随初始培养液中正十六烷浓度的增加而增加，且在各个浓度水平上，DQ01 细胞内富集的正十六烷量高于DQ02 体内正十六烷的富集量，说明在实验浓度范围内，2 菌株细胞外正十六烷浓度的增大可以加大2 株菌对正十六烷的运输富集。如当培养液中正十六烷初始浓度为20 mg·L-1时，20min 后，进入DQ01 细胞内的正十六烷浓度为2.76 mg·L-1，而当培养液中正十六烷初始浓度为40 mg·L-1 时，进入DQ01 细胞质中的正十六烷浓度为5.22 mg·L-1。原因为，正十六烷的浓度增大，加大了微生物对有机底物的接触几率，从而增加了进入细胞内的有机物的含量。但随着初始正十六烷浓度的增加，细胞质中富集的正十六烷含量趋于稳定，如正十六烷初始浓度分别大于50 mg·L-1 和30 mg·L-1 时，DQ01 和DQ02 细胞内富集的正十六烷增加缓慢，可见，正十六烷降解菌细胞膜内富集底物的能力与有机底物的初始浓度有关，这一现象与Kappeli.O 研究结果一致[13]。随着培养液中正十六烷含量的增加，微生物DQ01 和DQ02并没有表现出中毒性状，2 株菌体内富集的烷烃量反而增加，这是因为微生物通过调节细胞膜的流动性和细胞膜中不同脂肪酸含量比例来适应毒性逐渐增加的环境，并发挥对有机底物的降解功能[14]。随着培养液中烷烃含量的增加，细胞膜中顺式和反式不饱和脂肪酸的比例降低，不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸比例的增加都能增大细胞膜的流动性，从而弥补了有机物对微生物产生的毒性效应[15-16]，因此仍需深入分析DQ01 和DQ02 细胞膜中以及膜内不同脂肪酸的组成比例，从而更好地掌握微生物对烷烃的运输机制。
3.2 菌种运输富集正十六烷的机理分析
微生物能降解去除环境中的有害有机物，但对于微生物如何将这些有机物质运输到体内，人们的认识还很有限。被动转运是物质顺浓度梯度进行的跨膜转运方式，此过程不需消耗细胞本身代谢能，穿膜动力来自物质自身的热运动或浓度差。主动转运是通过消耗细胞自身代谢能进行的跨膜转运，需要膜上专一性载体,其转运速度一般比被动转运要快很多，可以逆浓度梯度运输，从而使生活在低基质环境中的微生物获得营养[17]。
这部分实验从细胞内外浓度差方面分析正十六烷的跨膜运输方式。从图2 可以看出，当培养液中正十六烷初始浓度为20 mg·L-1 时，在实验阶段吸附在DQ01 细胞表面的正十六烷浓度均小于被菌种运输富集到体内的正十六烷浓度，如在第0-10min 这个时间段里，DQ01细胞表面吸附的烷烃量呈增大趋势，并在第10min 达到吸附最大值1.10 mg·L-1，而DQ01 细胞内富集的烃浓度为2.72 mg·L-1，之后，细胞膜上吸附的烷烃量趋于稳定，整个实验阶段，DQ01 以逆浓度梯度方式将正十六烷运输到细菌体内。DQ02 运输正十六烷的方式与DQ01不同，在实验前10min，DQ02 细胞膜上吸附的正十六烷含量高于细胞内富集的烃含量，并在第10min 二者含量相同，均为2.01 mg·L-1，此后，DQ02 吸附的烷烃量开始下降，并低于细胞内富集的烷烃量。20min 后，DQ02 细胞膜上和体内富集的正十六烷含量趋于稳定，因此DQ02 首先以顺浓度梯度方式运输烷烃，之后，以逆浓度梯度方式将烷烃运输到菌种体内，即DQ02 先后通过被动扩散和主动运输运过程将烷烃运输到2 菌株体内。此外，DQ01 细胞膜上的烃含量明显低于DQ02 细胞吸附的烃，分析其原因可能与降解菌膜内，膜周和胞外酶的降解能力不同有关[18]。蜡状芽孢杆菌DQ01 的降解酶主要定域于膜周和膜内，且膜内酶的降解能力高于膜周酶，这种差别促使更多的十六烷以逆浓度梯度方式运输到细胞内被降解；芽孢杆菌DQ02 的降解酶主要定域于胞外和膜内，且降解能力相同，所以细胞膜内外的烃浓度差不明显。
3.3 NaN3 抑制条件下，菌种运输富集正十六烷的规律
王红旗[19]等人的研究表明加入正十六烷进入30 mmol·L-1 的NaN3 可使正十六烷在菌体内的富集量均减少80％以上，因此微生物运输烷烃是需要能量的。这部分实验选用能阻止细胞氧化磷酸化的NaN3 为抑制剂从而阻止ATP(三磷酸腺苷)的生成，如果加入合适浓度的NaN3 后菌种体内富集的正十六烷减少，则说明该菌种运输正十六烷的方式是需要能量的，相反，如果加入的NaN3 并未影响菌种体内富集正十六烷，则说明这个过程是不需要能量的被动运输过程。为进一步研究NaN3 抑制条件下不同时间内菌种主动运输富集正十六烷的情况，分别在1min，4min，5min，8min，10min，14min，18min，25min 等一系列时间内测定菌和上清液中正十六烷的浓度变化（其中8.5min 后加入30 mmol·L-1 的NaN3），以过程中不加入NaN3 后测定的菌体内正十六烷浓度为对照。
如图3a 和图3b 所示，在8.5min 加入NaN3 之前，2 菌株体内运输富集的正十六烷浓度略有增高，培养液中的正十六烷浓度基本不变，之后随着抑制剂NaN3 的加入，2 菌株体内富集的正十六烷明显下降，相应上清液中的正十六烷浓度则明显增加。以DQ01 为例，在加入NaN3 时，细胞膜内正十六烷含量为3.12 mg·L-1，而在加入NaN3 的第10min,细菌体内正十六烷含量迅速降为1.54 mg·L-1，而对照组中细胞内正十六烷含量为3.17 mg·L-1，上清液中的正十六烷含量也由加入NaN3 前的16.54 mg·L-1 增加到18.52mg·L-1。结果表明，NaN3 抑制了DQ01 对正十六烷的主动运输。发生这种变化的原因为，微生物细胞内，烃类物质的主动运输和生物降解是同时发生的，但当主动运输受阻时，进入到细胞内的底物减少，但存在于细胞内的烃被不断生物降解，因此，加入NaN3 后，菌株体内富集的烃含量降低，细胞外又有烷烃不断憎溶到水相中，因此上清液中烷烃含量会有所增加。相似的结果也在其它文献中有报道。Aristeides K[20]的研究表明在培养液中加入能阻止ATP 生成的叠氮化钠和2，4-二硝基苯酚都能使Arthrobacter sp. strain Sphe3 体内富集的菲含量。Whitman[21]等人发现P.
fluorescens 通过与能量有关的特殊运输系统降萘摄入体内。只有经过引诱处理的降解菌Mycobacterium sp. strain RJGII-135 才能通过主动运输方式摄取菲[22]。
3.4 细胞膜内包涵体的观察
石油类物质作为基质通常需要由特定的、诱导性的运输系统吸收到细胞内，这对石油的微生物降解尤其重要。那么，进入微生物体内的正十六烷又是以何种状态存在的还需要进一步试验分析。Kennedy[23]研究发现细菌Acinetobacter sp.在以正十六烷和正十七烷为唯一碳源时，体内均会出现明显的包涵体，而在以非烃类化合物为碳源时，细菌体内没有出现包涵体。
本次实验用TEM 对2 株菌体内的包涵体进行了观察，结果如图4 和图6 所示，以正十六烷为唯一碳源时，蜡状芽孢杆菌DQ01 和芽孢杆菌DQ02 的菌种体内均出现了包涵体，但2 株菌中包涵体的形态不同差异，如图4 所示，DQ01 体内的包涵体数目较多，呈透明、光滑的球状，而DQ02 的包涵体不规则，并分散在菌种体内（如图6）。而在以葡萄糖为唯一碳源时，2 株菌体内没有发现包涵体（如图5 和图7），说明这些包涵体完全只与烃类的代谢有关，微生物通过未修饰烷烃的运输作用把烷烃转移到细胞内的烷烃氧化部位，所以出现了包涵体，这些包涵体的主要成分可能是中性脂质和未改变的正十六烷，并且由含有多种蛋白质的单分子层磷脂薄膜包围[24-25]。但具体成分需要GC-MS 进一步分析。
Hector[26]等人发现在不同碳源培养基中，细菌Rhodococcus opacus strain PD630 体内会出现球状和不规则状包涵体，其形状的不同与组成包涵体的脂类和亲脂性化合物不同有关。
当Rhodococcus opacus strain PD630 以正构烷烃为基质时，其体内包涵体中的主要脂类物质为与基质含有相同碳原子数的烷链酸以及烷链酸；在以葡萄糖酸、乙酸和果糖为基质时，Rhodococcus opacus strain PD630 包涵体中的脂类物质主要是十六酸；而在以丙酸为基质时，组成包涵体的物质主要为奇数碳原子数的烷链烃，如十五烷和十七烷等。因此，需对DQ01和DQ02 体内包涵体中的组分进一步定性分析，从而揭示2 菌株对烷烃的富集机制。
4 结论
（1）微生物细胞内能富集正十六烷，且富集量随时间有逐渐增大趋势。不同浓度的正十六烷导致2 株菌对正十六烷的运输富集量不同，在实验范围内，正十六烷的浓度增大可以加大2 株菌对正十六烷的运输富集，但到一定浓度，细胞体内富集的正十六烷的量趋于稳定。
（2） 在20min 的实验周期内，DQ01 细胞膜上吸附的正十六烷含量低于体内富集的烷烃量，属于逆浓度梯度运输；而DQ02 细胞膜上吸附的正十六烷含量在前期高于体内富集的烷烃量，在后期呈相反状态，说明DQ02 先后通过顺浓度梯度和逆浓度梯度方式将烷烃运输到体内。
（3）加入NaN3 之前 DQ01 体内运输富集的正十六烷浓度略有增高，8.5min 加入NaN3后，菌种对正十六烷的运输富集能力明显下降，相应上清中的正十六烷浓度则明显增加。在加入NaN3 之前芽孢杆菌DQ02 的体内正十六烷浓度基本处于稳定水平，加入NaN3 后运输富集到菌体内的正十六烷也立刻减少，表明在微生物运输正十六烷的过程中是需能的，属于主动运输。
（4）以正十六烷为唯一碳源时，蜡状芽孢杆菌DQ01 和芽孢杆菌DQ02 的菌种体内均出现了包涵体，而包涵体并没有出现在以葡萄糖为碳源的2 株菌体内, 说明DQ01 和DQ02可以未加修饰地将烷烃运输富集在体内的初始氧化部位。2 株菌中包涵体的形态存在一定差异，以正十六烷为唯一碳源时，DQ01 体内的包涵体数目较多，呈透明、光滑的球状，而DQ02 的包涵体呈不规则状，并分散在菌种体内。造成这一现象的原因可能与组成包涵体的脂类物质有关。
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