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论视神经离断对神经干细胞定向诱导分化的影响
[论文关键词]干细胞；组织培养；视网膜神经节细胞；细胞分化；
[论文摘要] 目的 探讨大鼠视神经离断对神经干细胞一上丘组织共培养诱导分化的影响。方法采用机械分离，无血清选择培养的方法从孕14d的胚鼠上丘中获取神经干细胞并进行传代培养。使用免疫荧光技术对神经干细胞进行鉴定。采用显微手术的方法建立大鼠视神经离断模型，分别取正常大鼠、假手术和视神经离断大鼠的上丘组织进行体外培养。使用组织一细胞共培养系统将大鼠上丘组织与神经干细胞共培养，观察干细胞分化过程，对分化细胞进行鉴定，并与干细胞的自然分化过程进行比较。结果从胚鼠上丘中获得的细胞在无血清培养条件下聚集呈球形悬浮生长，可形成单细胞克隆，具有多向分化能力，经免疫荧光鉴定证实为神经干细胞。视神经离断大鼠的上丘组织与胚胎上丘源神经干细胞共培养可以促进神经干细胞的分化，并诱导分化出Thyl.1阳性的视网膜神经节细胞。结论从胚胎大鼠上丘可以分离培养出神经干细胞，与视神经离断大鼠的上丘组织共培养可以诱导上丘源神经干细胞分化为视网膜神经节细胞。
1材料与方法
1.1主要材料和试剂
孕14d和3个月龄SD大鼠均由复旦大学医学院实验动物中心提供。高糖DMEM／F12、Neurobasa1、N2、B27购自美国Gibeo公司；EGF、b-FGF购自美国R&D公司；小鼠抗Nestin单克隆抗体、小鼠抗Thyl.1单克隆抗体购自美国Chemieon公司；兔抗GFAP购自武汉博士德公司；兔抗MAP-2单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。
1.2动物分组与视神经离断模型
取3个月龄sD大鼠30只，雌雄不拘，随机分为3组：正常对照组、假手术组和视神经离断组，每组动物均为10只。视神经离断组大鼠随机选择一侧眼，在手术显微镜下钝性分离显露视神经；在离后极约2 mm处剪断视神经。术后于直接检眼镜下观察视网膜血供良好者纳入试验。假手术组动物外科操作同视神经离断组，但不离断视神经。正常对照组则不做任何处理。
1.3胚胎上丘NSCS的分离与培养
取孕14d的SD大鼠，孕鼠孕龄的计算方法为：将雌雄大鼠合笼后，次晨检查发现阴栓者为孕0天。按照大鼠脑解剖图谱细心分离出上丘组织。胚胎上丘NSCS的分离与原代培养程序参见冯东福等已建立的方法。
1.4单细胞克隆及鉴定
将第2代的神经干细胞球，吹打成单细胞悬液。使用连续稀释法，最终细胞密度为100／ml。参照Reynolds和Weiss的方法，建立单细胞克隆。
使用细胞免疫荧光法对传4代的细胞克隆进行鉴定，一抗为小鼠抗Nestin单克隆抗体(1:100)，二抗为羊抗小鼠IgG Cy3(1:10)。使用TCS-SP2型激光共聚焦显微镜对荧光标记后的细胞克隆球进行观察，并进行计算机三维图像重建，激发波长为543mm。具体方法见冯东福等的报道。
1.5上丘组织培养
假手术组和视神经离断组大鼠在术后5d断头处死，取手术对侧的上丘组织，正常对照组随机取单侧上丘组织。上丘组织培养采用我们已经建立的方法。
1.6双室组织一细胞共培养系统
该系统由上下两室组成。上室为透明PET微孔(孔径0.4μm)滤膜培养小室(Becton Dickinson产品)，下室为配套的24孔培养板，可将上室悬吊起来。共培养时将上下室组合起来。
1.7神经干细胞的自然分化
取传4代的NSCS悬液，从500r／min离心5min，弃上清，加入干细胞分化培养液(Neurobasal培养液+B27(1：50)+10％FBS+谷氨酰胺4 mmol／L)轻柔吹打。调整细胞密度为1×105／ml后将1 ml悬液滴入下室，上室中不放组织块，仅加入分化培养液。把接种后的双室组织一细胞共培养系统放人C02培养箱中于37℃ 、5％CO2条件下贴壁培养。隔日用相差显微镜观察细胞生长分化情况，贴壁培养14d后进行荧光免疫细胞化学染色。1.8上丘组织一神经干细胞共培养诱导分化
将传4代的NSCS悬液以500r／min离心5min，弃上清，加入分化培养液轻柔吹打，调整细胞密度为1×105／ml后取1ml悬液滴入下室中于37℃ 5％C02条件下贴壁培养。3d后将已在体外培养4d的上丘组织移入共培养系统进行共培养。6d后将上室移去，神经干细胞继续培养至14d。
1.8分化细胞的鉴定
细胞免疫荧光染色步骤同前，根据需要上不同的一抗，抗体工作浓度分别为：MAP-2(1:50)、GFAP(1:100)、Thyl.1(1:100)。根据不同的一抗选择FITC或Cy3荧光二抗。阴性对照使用PBS液代替一抗。对Thyl.1阳性的培养孔，每孔随机选择3个克隆，在细胞疏松区域选择4个不同视野，记数总细胞数和Thyl.1阳性细胞数，计算阳性率。
2 结果
2.1 上丘神经干细胞克隆形成及鉴定
大鼠胚胎上丘细胞接种48h后培养液明显黄变，大部分细胞死亡，存活的部分细胞胞体增大，折光性增强，伴有明显光晕。部分细胞出现分裂相，细胞可成对出现。随着培养时间的延长，细胞团逐渐增大，呈球形悬浮生长，边缘细胞折光性较强。对第2代细胞进行单细胞克隆培养后发现，细胞可形成亚克隆，这些来自单个细胞的亚克隆可以进行传代培养，并大量增殖。
使用激光共聚焦显微镜，进行三维重建后可以清晰地看到克隆球呈Nestin阳性，中心的细胞较为
2.2分化细胞的鉴定
NSCS的自然分化和各共培养组合诱导分化分化情况。各组神经干细胞大部分均分化为GFAP阳性的神经胶质细胞。少量分化为MAP-2阳性的神经元。但只有上丘源NSCS与视神经离断组的上丘组织共培养后可见有Thyl.1阳性的视网膜神经节细胞分化。在该组分化的细胞中，Thyl.1阳性细胞的比率为14.92％
2.3神经干细胞的自然分化
神经干细胞克隆在撤除丝裂原24h后贴壁。随着时问延长克隆球逐渐变扁平，并以克隆为中心产生放射状细胞迁移。克隆球边缘的细胞形状较不规则，多数细胞呈梭形或多角形，发出短而细的突起。7d后部分细胞可见长突起，细胞的折光性也各有不同。在相差显微镜下可见胞体较疏松，边缘部分有散在的迁移细胞，部分细胞可见有突起发出，亦呈Nestin阳性。 大、形态不规则、具有多个粗突起的胶质样细胞数量较多。而胞体有很强光晕，呈圆形或椭圆形、具有1～2个细长突起的神经元样细胞数量较少。随着神经干分化时间的延长，克隆球四周的细胞逐渐增多，迁移的距离也逐渐增加。在培养2周时出现大量细胞迁移，而克隆球边缘则逐渐模糊
2.4组织-神经干细胞共培养诱导分化
上丘神经干细胞经与组织共培养24h后均贴壁生长，克隆球逐渐变扁平。部分克隆球边缘有细胞突起发出，开始分化过程。在培养48h后可见细胞向外迁移，在相差显微镜下呈明显的“太阳征”在培养5d时，以克隆为中心产生的
3 讨论
虽然干细胞的体外诱导分化已经有较多研究，但在体外诱导NSCS向RGCs分化，特别是采用上丘组织与NSCS共培养诱导分化的研究目前还未见报道。笔者采用了一种新型的双室共培养诱导NSCS分化模式，细胞与组织不在一个平面上。下室为多聚赖氨酸包被的培养板，用于细胞培养。上室底部的PET膜使用细胞外基质包被，并经过蚀刻处理，有利于细胞的迁移，其组织贴壁率明显优于传统培养载体。组织接种到小室底部PET膜上后，与下室组合在一起进行共培养。由于PET膜上分布的孔径为0.4μm，所以膜上细胞分泌的分子会穿过PET膜孔到达下面，但细胞却无法进行直连续放射状细胞迁移，这些细胞的形态大多是圆形或梭形，多数细胞有较长突起，也有一些细胞体未见明显突起长。在培养2周后，大部分克隆明显减小，而不同克隆分化出的细胞交织成网，细胞间的突起相互连接。接接触，因此可以排除细胞接触因素的影响。
在哺乳动物中枢神经系统的发育过程中，各种神经元与对应的靶组织建立突触联系往往是其存活和进一步成熟分化的重要条件。大鼠出生时视觉系统尚未成熟，视网膜神经细胞，特别是节细胞，在出生后的成熟和分化，皆有赖于其靶组织一中脑上丘提供神经营养和诱向因子。因此笔者通过将NSCS与RGCS的靶组织共培养的方法，探讨靶组织在体外环境下对NSCS分化的影响。笔者发现视神经离断成年大鼠的上丘组织均可诱导NSCS分化为RGCS，而假手术组和正常对照组的上丘组织则无此作用。
上丘对RGCS的作用是通过一系列复杂的化学因子调节的，其中较为重要的是神经营养因子的作用。Frost等报道在上丘中脑源性神经营养因于的表达水平与RGCS发育程度相关，出生后15d内的仓鼠上丘BDNF保持在较高水平，而在成年期其含量下降约1／3左右。Kretz等则发现另一种神经营养因子——睫状神经营养因子在发育期上丘的表达也具有同样的时间依赖性。这些神经营养因子在发育期的高表达，对于神经干细胞的增殖、分化同样具有重要作用。笔者从胚胎大鼠上丘组织中成功分离出具有多向分化能力的NSCS，也说明发育期的上丘组织存在NSCS存活、分化的微环境。
但对于成年动物，上丘对视网膜细胞的促进生长作用逐渐消失。而在视神经离断后，上丘可以再现胚胎期对视网膜神经节细胞的诱向作用。在胚胎发育过程中，未成熟星形胶质细胞表达vimentin，但随着发育完成vimentin的表达逐渐消失。在成年动物上丘中，已无vimentin表达。但在视神经损伤后，上丘组织中再次出现了vimentin阳性表达的未成熟星形胶质细胞。视神经损伤的发生激活了星形胶质细胞的“再发育”，这些细胞类似于胚胎上丘细胞的vimentin阳性细胞，可以分泌视网膜细胞发生所需要的神经营养和诱向因子。此外，视神经损伤后的上丘组织中还出现了小胶质细胞的大量增殖，这些小胶质细胞对星形胶质细胞各种细胞外基质(ECM)的表达具有重要作用。ECM是由各种糖蛋白、黏蛋白、神经黏附因子等组成，在空间上是神经微环境的重要组成部分，可以通过调整黏附和信号分子的聚集，起到微环境信号放大器的作用。
存笔者的实验中，正常成年大鼠上丘组织虽然也可以在体外培养条件下生长，但并不能诱导NSCS向视网膜神经节细胞分化。而上丘源NSCS与视神经离断后5d的大鼠上丘组织共培养则可以向RGCS分化，这可能与视神经离断后上丘细胞发生的一系列功能的“激活”有关。由于笔者采用的共培养系统排除了细胞间直接接触的影响，因此，视神经离断后上丘细胞可能通过分泌某种因子对NSCS的分化方向产生影响。对相关因子的进一步研究将可能有助于对视神经损伤再生机制的了解。同时，体外诱导NSCS定向分化为RGCS的成功也为视神经损伤修复提供了新的细胞来源。然而，这些分化而来的RGCS虽然通过细胞免疫学检测证明。
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