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格列喹酮促进C2C12细胞摄取葡萄糖
1 引言
胰岛素抵抗和β细胞功能缺陷是2 型糖尿病特征性病理生理学改变，其中胰岛素抵抗是2 型糖尿病的发病机制中一重要环节，胰岛素抵抗主要表现之一为胰岛素敏感组织(肌肉、脂肪组织)葡萄糖摄取减少。格列喹酮作为第二代磺脲类药物，其主要作用是通过促进胰岛素分泌而控制血糖。随着学者们对磺脲类药物作用机理研究的深入，格列喹酮经典途径以外的降糖机制也逐渐引起大家的关注。Rinninger F 等[i]研究发现，格列喹酮可通过诱导体外培养的肝脏细胞糖原合成增加而发挥胰腺外作用，Marco 等[ii]研究发现格列喹酮可诱导3T3-L1成纤维细胞PPARγ 靶基因GLUT4 的表达，其作用效应与吡格列酮相近。本研究旨在通过体外葡萄糖摄取实验，观察格列喹酮对C2C12 细胞葡萄糖摄取作用及对胰岛素刺激的糖摄取的影响，并初步探讨格列喹酮的胰腺外降糖作用机制，为进一步阐明其临床作用提供新的实验依据。
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 细胞株
小鼠成肌细胞株(C2C12) ,由德国乌尔姆大学刘跃飞教授惠赠。
2.1.2 主要试剂
DMEM 培养基（Gibco 产品，高糖型），胎牛血清（杭州四季青公司），马血清（Gibco产品），胰蛋白酶、DEPC、溴化乙锭（Sigma 公司），Trizol（Invitrogen 公司），逆转录酶MMLV 酶、Taq 酶（MBI 公司），GLUT4 及β-actin 引物由上海生工合成，100 bp LadderDNA Marker (Axyden 公司)，琼脂糖（Gibco 公司），3H -2-脱氧葡萄糖（Amersham 产品），格列喹酮（北京万辉双鹤药业），其它试剂均为国产分析纯。
2.2 方法
2.2.1 C2C12 的培养
加入含 10%胎牛血清的DMEM 培养基，置于37℃、含5％CO2 的培养箱中培养，隔日换液，待细胞生长至70％~80％融合时按1：4 传代。
2.2.2 C2C12 诱导分化
C2C12 细胞达80%左右融合时，传代接种于干预板中，待生长至80%~90%融合时，换用分化培养基（含2%马血清的DMEM 培养基）诱导分化(day0)，每24 小时换液一次；5-7天后90%以上成为成熟骨骼肌细胞用于实验。
2.2.3 葡萄糖氧化酶法检测细胞培养基中葡萄糖水平
细胞接种于 6 孔板，给药组在细胞分化后分别加入含10-5mol/L 的格列喹酮、10-7mol/L胰岛素以及10-5mol/L 格列喹酮+10-7mol/L 胰岛素的DMEM，同时设立空白组、不含细胞的DMEM 组。温育12 h 后再将培养基移出并用葡萄糖氧化酶法检测培养基中的含糖量。用DMEM 组含糖量的平均值减去其余各孔的含糖量，即是12h 各孔细胞的葡萄糖消耗量。收集细胞提取总RNA。
2.2.4 采用四甲基偶氮唑盐法评估格列喹酮对C2C12 细胞增殖的影响
取体外培养的C2C12 细胞，0.25%的胰酶溶液消化，制成单细胞悬液，1000 r/min 离心5min，以含10％胎牛血清的DMEM 培养基重悬。血细胞计数板进行细胞计数，细胞悬液密度为3.4×106 /L，接种至96 孔板，200μL/孔。实验共分4 组：空白对照组、10-7mol/L 胰岛素组、10-5mol/L 格列喹酮组、格列喹酮+胰岛素组，6 个平行孔/组。各组在37℃、5％CO2细胞培养箱内常规培养。待细胞融合率达80%且未出现细胞分化时，药物组分别向C2C12细胞中加入含对应浓度药物的无血清培养基，空白对照组则向C2C12 细胞中加入单纯无血清培养基。各组细胞干预12 h 后进行四甲基偶氮唑盐检测。即每孔加入5mg/mL 的四甲基偶氮唑盐液20μL，37℃继续培养4 h，镜下可见紫蓝色针状结晶。吸出孔内培养基后，每孔加入二甲基亚砜200μL，室温下将平板置于微孔板振荡器上振荡10 min，待结晶物溶解后，置于酶联免疫仪于490 nm 处检测各孔吸光度值。
2.2.5 3H -2-脱氧葡萄糖摄取实验
细胞接种于 24 孔板，给药组在细胞分化后分别加入含 10-5mol/L 的格列喹酮、10-5mol/L格列本脲的DMEM，同时设立空白组。用KRP 缓冲液洗涤3 次后，加入含10-7mol/L 胰岛素的KRP 缓冲液，在37℃继续培养30min，然后加入3H -2-脱氧葡萄糖，使终浓度为3.7×104Bq/L，作用15 min 后，用冷PBS 洗涤3 次，用0.1mol/L 的NaOH 裂解细胞，取细胞裂解液用液闪仪计数其每分钟计数(CPM)。每一样本测定的CPM 值用与对照组的比例表示。
2.2.6 RT-PCR 法检测GLUT4 mRNA 表达
采用 Trizol 一步法提取各组细胞的总RNA，经紫外分光光度计测定RNA 的A260nm 与A280nm 比值在1.60～1.90 之间。取4μl 总RNA 为模板逆转录，根据文献，并与从Gene Bank上下载的人GLUT4 mRNA、β-actin mRNA 核苷酸序列核对，由上海生工合成GLUT4 和β-actin 单核酸引物。GLUT4 上游: 5’- gcccgaaagagtctaaagcg -3’ ， 下游: 5’-actaagagcaccgagaccaa-3’，扩增产物长312bp。β-actin 上游:5’- cgtgcgtgacattaaagag -3’，下游: 5’-ctggaaggtggacagtgag- 3’，扩增产物长435bp。扩增条件: 95℃ 5min 预变性，然后95℃ 45s，58℃ 45s，72℃ 45s 进行35 个循环，再以72℃延伸10min，再以72℃延伸10min。反应完成后取5μl PCR 产物于2%琼脂糖凝胶（含0.5mg/ L 溴化乙锭）电泳，用Sensicapture 自动凝胶成像分析仪扫描凝胶图谱，LabImage 分析软件对RNA 条带进行分析，得出GLUT4 与内参照条带β-actin 的吸光度比值，比较各组GLUT4mRNA 相对表达情况。
2.3 统计学处理
应用 SPSS 13.0 软件包对实验数据进行统计，所有数据都用?x±s 表示，采用one-wayANOVA 进行显著性检验，组间比较采用S-N-K 检验，以P < 0.05 为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 格列喹酮对C2C12 细胞培养基中葡萄糖消耗的影响
结果显示，干预12h 后，胰岛素组C2C12 细胞葡萄糖消耗量明显增加，高于空白组（12.34±0.55 vs 7.86±0.63，P<0.01），格列喹酮组细胞耗糖量亦明显增加（10.95±0.46 vs 7.86±0.63，P<0.01），格列喹酮+胰岛素组细胞耗糖量较胰岛素组增多（13.77±0.73 vs 12.34±0.55，P<0.01）。
3.2 格列喹酮对C2C12 细胞增殖的影响
四甲基偶氮唑盐检测结果表明，细胞处理12 h 后，与空白组比较, 胰岛素组、格列喹酮+胰岛素组平均吸光度值均显著增加（0.74±0.09，0.76±0.09 vs 0.54±0.06，P<0.01），而格列喹酮组平均吸光度值无明显变化（0.55±0.089 vs 0.52±0.063，P>0.05）。
3.3 格列喹酮对C2C12 细胞葡萄糖摄取的影响
C2C12 细胞在基础状态下对葡萄糖有一定的摄取，胰岛素刺激可使细胞葡萄糖摄取增加（为空白组的1.68±0.09 倍，P<0.01）；10-5mol/L 的格列喹酮、10-5mol/L 格列本脲孵育细胞12h 后，与空白组相比，细胞对葡萄糖的摄取均增加（分别为1.52±0.23 倍、1.23±0.16 倍，P<0.01）；与格列苯脲相比，格列喹酮组细胞葡萄糖摄取增高更明显（P<0.01）；在胰岛素存在的情况下，格列喹酮组细胞葡萄糖摄取明显增加（为空白组的1.93±0.12 倍，P<0.01），且高于胰岛素组（P<0.01），见格列喹酮对C2C12 细胞葡萄糖摄取的影响。
3.4 格列喹酮对C2C12 细胞GLUT4 mRNA 表达的影响
胰岛素和格列喹酮干预C2C12 细胞12 小时结果显示，胰岛素组GLUT4 mRNA 表达高于空白组（0.73±0.04 vs 0.47±0.02，P<0.01），格列喹酮组GLUT4 mRNA 表达与空白组相比无明显差异（0.50±0.02 vs 0.47±0.02，P>0.05），格列喹酮+胰岛素组与胰岛素组相比无明显差异（0.50±0.03 vs 0.50±0.02，P>0.05）。
4 讨论
格列喹酮作为第二代磺脲类药物，其主要作用是通过促进胰岛素分泌和增强胰岛素的外周作用来控制血糖，此外，它还具有广泛的胰腺外作用。Yarat 等[iii]研究显示，格列喹酮可显著减少糖尿病大鼠晶状体内非酶糖基化蛋白及总蛋白水平，显著增加谷胱甘肽水平。
Yanardag 等[iv]发现格列喹酮对糖尿病大鼠的肝脏损伤有保护效应。另有研究显示，格列喹酮能抑制糖基化终产物诱导的人肾系膜细胞（HRMC）正常 T 细胞表达分泌的调节活化蛋白（RANTES）的表达和分泌[v]，提示格列喹酮可降低具有较强趋化炎症细胞作用的RANTES水平从而可能在糖尿病肾病的防治中发挥一定的作用。
胰岛素抵抗是2 型糖尿病发病机制中一重要环节，经典定义是指需要超过正常量的胰岛素才能在胰岛素的效应器官产生正常生理效应，现代的胰岛素抵抗概念则泛指胰岛素促进周围组织摄取和利用葡萄糖的作用减低[vi]。骨骼肌占人体重的40%以上，是胰岛素刺激状态下摄取葡萄糖和代谢葡萄糖的最主要组织之一，在体内糖代谢平衡中发挥重要作用。葡萄糖是一种极性分子，不能以自由扩散的方式通过细胞膜，绝大多数组织细胞都必须借助细胞膜上的葡萄糖转运体（GLUTs），通过易化扩散的方式摄入葡萄糖。GLUTs 有多种亚型，其中GLUT1 主要分布于脑部血管内皮细胞(包括血脑屏障)和红细胞膜上，也低水平表达于脂肪组织、肌肉和肝脏，这种广泛表达的GLUT1 为许多细胞提供基础状态下的葡萄糖转运。
GLUT4 是存在于骨骼肌、脂肪组织中转运葡萄糖的载体，它的表达和功能的改变可能涉及肌肉和脂肪细胞胰岛素抵抗[vii，viii，ix]。
本实验选用源于小鼠的成肌细胞株C2C12，通过马血清诱导其退出细胞增殖周期，促进其分化为成熟骨骼肌细胞[x]。采用葡萄糖消耗实验，观察在格列喹酮处理下培养基中葡萄糖消耗程度，可以直观地反映该药物对骨骼肌细胞糖代谢的影响。结果显示：在无胰岛素存在的情况下，格列喹酮能增加C2C12 细胞耗糖量，但未见其对细胞活力有影响，提示这种耗糖量的增加并不是因为细胞活力变化引起的，从而认为可能是葡萄糖摄取增多的结果；联用胰岛素和格列喹酮进行处理时，呈现明显的协同降糖作用。鉴于葡萄糖消耗实验观察的是细胞在一段时间内消耗葡萄糖的总和，在这段相对“漫长”的时间内，除了GLUT4 之外，骨骼肌细胞中存在的其他的一些非胰岛素敏感的、转运速度缓慢而持久的GLUT1 等载体对葡萄糖转运作用可能都叠加在一起。而葡萄糖摄取实验观察的是在短时间内细胞对同位素标记的脱氧葡萄糖的摄取，考察的是格列喹酮对细胞快速摄取葡萄糖能力的影响，对于骨骼肌和脂肪等胰岛素敏感细胞，主要反映的是对GLUT4 功能的影响。结果显示，C2C12 细胞在基础状态下对葡萄糖有一定的摄取，但在胰岛素刺激以后，增加倍数不明显，10-7mol/L 的胰岛素刺激下糖摄取能力增加也不到2 倍，这与文献报道的C2C12 细胞系的GLUT4 表达量相对不足相一致，即使分化融合为肌管后对胰岛素的反应性也较差[xi，xii]。实验观察到格列喹酮干预C2C12 细胞12h 后表现出促进细胞糖摄取的效应，且能增强胰岛素依赖的葡萄糖摄取作用，与葡萄糖消耗实验结果基本一致。
胰岛素和肌肉收缩被认为是调节骨骼肌糖代谢的主要生理因素，且两者的作用有协同性[xiii]。一般认为可从三方面来调节 GLUT4 的功能，增加骨骼肌对葡萄糖的摄取。首先可通过上调 GLUT4 蛋白的含量，可能的机制是促进 GLUT4 的基因表达和蛋白合成，或减少其降解，或是两者兼有；其次是通过增加 GLUT4 的转位，使细胞膜上的 GLUT4 增多，从而促进葡萄糖的摄取；还可以通过调节细胞膜上的 GLUT4 内在活性，这可能是通过直接调节GLUT4 本身或通过与其他调节分子相互作用而实现的[xiv]。本研究结果显示格列喹酮能促进C2C12 细胞葡萄糖摄取，但并未发现其增加细胞GLUT4 基因表达，推测其促细胞摄取葡萄糖的作用可能存在其它机制，如对GLUT4 翻译水平的正向调节作用、增加GLUT4转位或增强其内在活性等。因此格列喹酮对GLUT4 的作用还有待于进一步研究。
5 总结
本研究表明格列喹酮能促进小鼠骨骼肌细胞葡萄糖摄取，且可增加胰岛素介导的葡萄糖的转运，提示格列喹酮可能改善胰岛素的敏感性。细胞对葡萄糖的摄取是一个复杂的信号转导过程，关于格列喹酮刺激糖吸收的机制以及与胰岛素信号通路中其它因子的关系，尚待进一步的研究。
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参考文献
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