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研非复制性腺病毒携带AT2
0 引言
1975 年Kohler 和Milstein 首先报道，用细胞杂交技术，使经绵羊红细胞(SRBC)免疫的小鼠的脾细胞，与小鼠的骨髓瘤细胞融合，并由此创建了第一个B 细胞杂交瘤细胞株，获得了抗SRBC 的单克隆抗体。他们首先创立了将能分泌特异性抗体的B 淋巴细胞同无限繁殖的骨髓瘤细胞融合技术，为单克隆抗体的制备奠定了基础。这是免疫学，乃至医学史上的一个里程碑。
单克隆抗体以特异性高、性质均一和针对特定靶点定向制备等诸多优点而广泛应用于各种疾病的治疗，特别是在肿瘤领域内的应用备受关注。美国FDA 先后批准了10 多个用于治疗肿瘤的抗体药物，都是全长抗体。虽然单克隆抗体在肿瘤治疗中发挥了重要的作用，但全长单克隆抗体治疗肿瘤成本太高：治疗肿瘤的抗体需要量极多且纯度要求高，目前的生物制药工艺难以满足市场的需求，大规模、高密度的哺乳动物细胞培养技术是目前国际上的一大难题，这些均导致高生产成本及昂贵的价格，一般患者难以承受。
因此，本课题的目的是利用非增殖腺病毒作为载体携带全长抗体基因在体内表达全长抗体，这样可以避免在体外用哺乳动物细胞表达抗体，以及纯化等复杂而且昂贵的规程。AT2是一个对肿瘤有明显疗效的抗EGFR 单克隆抗体Cetuximab。由于EGFR 在很多肿瘤中都有过量表达，在肿瘤的发生、生长、抗药性和转移性中都起到了重要的作用。Cetuximab 对过量表达EGFR 的肿瘤有良好的治疗作用，现已被批准用于头颈癌、直肠癌和肺癌的治疗，无论是单独使用还是与其它药物联合应用都有很好的效果，只有很小的副作用，出现严重反应的概率不及万分之一。Cetuximab 单抗应用其它肿瘤治疗的研究也在大力的开发中，在肿瘤的治疗中有很大应用前景，但是由于其生产成本过高，国内普通患者难以承担，而抗体基因治疗正好解决了这个问题。本研究根据人体内密码子的偏爱性选择修改了部分氨基酸密码子，构建了修改密码子后的重组腺病毒载体。体外实验表明，通过修改密码子后提高了抗体的表达量，通过Western 和IFN 实验检验，无论修改密码子与否，重组腺病毒在293 细胞中表达的抗体与商品化的 Cetuximab 单抗相近的特性，分子量大小一致，与抗原EGFR 有很好的结合，说明我们构建的载体表达的抗体是有活性的。
1. 材料和方法
1.1 材料5 型腺病毒骨架质粒pBHGE3（加拿大Microbix Biosystems 公司），人表皮鳞癌细胞株A431、SK-Br-3 细胞和人胚胎肾细胞293 细胞(购于ATCC)，DMEM 细胞培养液，胎牛血清FBS(购于GIBCO 公司),穿梭载体pDC339 (本实验室构建)。引物和抗体基因由上海生工公司合成。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养A431 细胞、SK-Br-3 细胞和293 细胞在5%CO2，37℃ 条件下培养，培养液为含10%FBS的DMEM。
1.2.2 构建携带抗体基因重组
腺病毒载体我们首先分别合成修改密码子前后的AT2 抗体基因的轻链及重链，且在轻链及重链前面各自合成抗体的信号肽基因，用IRES 元件连接抗体的轻链和重链基因，以实现AT2 抗体的重链和轻链的平衡性及完整性，经PCR 引入酶切位点后，逐步把重轻链基因装入载体pDC339 中。
经过酶切和 PCR 鉴定后测序。PCR 鉴定穿梭载体pDC339-AT2 和pDC339-NAT2(修改过密码子)重、轻链的引物分别是GT340+GT341（轻链）、GT342+ GT343（重链）和ATNL-1+ ATNL-4（轻链）、 ATNH-1 +ATNH-4（重链）。测序正确后的穿梭载体与5 型腺病毒骨架质粒pBHGE3 利用转染试剂Lipofectamine 2000 共转染至293 细胞，通过同源重组的方法获得携带目的基因的重组病毒。共转染后9～14 d 出现病毒空斑，经过PCR 法鉴定目的基因正确后，得到表达Cetuximab 抗体的重组腺病毒载体Ad5-AT2 和Ad5-NAT2。简化示意图如下：
1.2.3 病毒扩增和纯化
病毒滴度测定重组腺病毒载体Ad5-AT2 和Ad5-NAT2 经鉴定正确后进行大扩后，用HPLC 法在纯化车间纯化，应用50%组织培养感染剂量法(TCID50)测定病毒滴度。
1.2.4 重组腺病毒表达的抗体检测
实验铺板 293 细胞，培养过夜后，按MOI=10 分别加入两个病毒，收上清用于抗体的检测实验。用双夹心ELISA 法测定抗体的表达量；用Western 鉴定其与商品化的Cetuximab 单抗比较分子量大小；间接免疫荧光实验是根据抗原抗体反应的原理，用荧光标记抗体作为分子探针，检查抗体Cetuximab 与A431 细胞膜上的抗原EGFR 结合的特异性，同时用EGFR 阴性的SK-Br-3 细胞做阴性对照。
2. 结果
腺病毒穿梭载体pDC339-AT2 和pDC339-NAT2 的酶切和PCR 鉴定结果。
应用50%组织培养感染剂量法(TCID50)测定病毒滴度，Ad5-AT2 和Ad5-NAT2 的病毒滴度分别是1.2×1010pfu/ml，1.0×1010pfu/ml。
用双夹心 ELISA法测定病毒抗体的表达量：Ad-AT2 与Ad-NAT2 相比的表达量分别是：
25.2±5ng/ml 和285.3±5ng/ml，通过修改密码子较大的提高了抗体的表达量。
重组腺病毒Ad-AT2、Ad339-NAT2 按MOI＝10 转染细胞株293，感染72 小时后用Western Blot 方法检测细胞上清中Cetuximab 抗体与商品化的抗体比较分子量大小。查看EFNB2与精神分裂症样本的关联。
3 讨论
治疗各种疾病、顽症中有巨大的优势，但是由于其自身的某些性质，加上目前我们的生产抗体的技术和工艺，限制了抗体的应用。在当前的生产抗体的工艺比较复杂，需要综合多项技术，工艺和技术都被少数公司垄断，而且抗体的需要量也在增大，最后导致抗体的治疗成本极高。
为了降低成本和提高抗体治疗效果，基因治疗是一种新型有效的手段，我们可以通过把全长抗体基因装入载体，通过载体带进体内，是抗体在体内表达。这样既可以免去体外生产抗体众多复杂的过程，降低成本，又可以使抗体更好的在体内持续作用，更好的到达组织。
因此，如何找到一个安全的，有效的载体是关键。腺病毒成为一个重要的载体，由于我们对其研究得比较清楚，我们对其进行改造，删除负责病毒复制的E1A 区以及其它多余的区域。
腺病毒作为载体应用于基因治疗中有众多优点，在目前的条件下，腺病毒载体相对于其它载体，更适合作为基因治疗的载体。
根据密码子的偏爱性，我们收集了高表达的氨基酸密码子，修改了部分抗体基因的密码子，以此来提高抗体的表达量。经Western 鉴定和IFN 实验证明腺病毒载体表达的抗体是完整和有活性的，特异性也很好，可以应用下一步的治疗研究。
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