研究凋亡素参与正常细胞核蛋白表达差异

时间：2023-03-02 09:34:54 临床医学毕业论文我要投稿

相关推荐

研究凋亡素参与正常细胞核蛋白表达差异

　　1．引言

研究凋亡素参与正常细胞核蛋白表达差异

　　凋亡素能够特异引起肿瘤细胞与转化细胞的凋亡，这种细胞凋亡是非P53 依赖的，而不能够导致正常细胞的凋亡，这与凋亡素的核定位有关。凋亡素是一种在细胞质与细胞核之间穿梭的蛋白。无论是在肿瘤细胞还是正常细胞内，凋亡素都能够通过核定位信号进入细胞核。然而在肿瘤细胞中，凋亡素被修饰，导致出核信号的失活，定位在细胞核内，引起肿瘤细胞的凋亡；而在正常细胞中，凋亡素又通过出核信号出核，定位在细胞浆内，不引起正常细胞的凋亡。

　　综上所述，肿瘤细胞与正常细胞之间的蛋白表达一定存在着某种差异，使得凋亡素在肿瘤细胞中被特异地修饰。本实验通过蛋白质组学的方法来寻找肿瘤细胞与正常细胞核内的蛋白表达差异，以期望能够进一步探讨凋亡素诱导肿瘤细胞特异凋亡的机制。

　　2．材料和方法

　　2.1 实验材料PureyieldTM Plasmid Midiprep System(Promega)、RPMI1640 细胞培养基、新生牛血清（GIBCO）、转染试剂LIPOFECTAMINE 2000(Invitrogen)、蛋白酶抑制剂（sigma）、pEGFP-C1、pEGFP-C1-apoptin 由伦敦大学医学院Tavassoli 博士惠赠，JM109 菌株由本室保存，HepG2 细胞、L02 细胞由本校遗传教研室馈赠。

　　2.2 pEGFP-C1-apoptin 载体的提取按照 Promega 公司PureyieldTM Plasmid Midiprep System 提取试剂盒进行质粒的提取。

　　2.3 细胞培养用含 RPMI1640、10%新生牛血清的培养液，置37℃、5%CO2 及饱和湿度的恒温箱中培养HepG2 细胞、L02 细胞，每2d 传代一次。

　　2.4 细胞转染进行 24 孔板贴壁细胞的瞬时转染，将pEGFP-C1-apoptin 质粒分别转染进HepG2 和L02两种细胞。

　　2.5 激光共聚焦检测apoptin 定位转染后24、 48h 将 24 孔细胞培养板取出,在各组细胞的培养基中加入 Hoechst 33342染液(终浓度为 10μ g/ml), 37℃恒温避光染色 15min, PBS 洗3 次,去除未结合的 Hoechst33342, 激光共聚焦荧光显微镜下观察,拍照。

　　2.6 细胞核蛋白提取用含 RPMI1640、10%新生牛血清的培养液，置37℃、5%CO2 及饱和湿度的恒温箱中培养转染24h、48h 后的HepG2 细胞、L02 细胞。收集上述细胞，常规消化，用PBS(ph7 .2)洗1 次，4℃ 1080rpm 离心5min。弃上清，细胞压积加缓冲液A 400μl，蛋白酶抑制剂2μl，混悬，冰上肿胀15 min，再加10％ NP-40 50μl，涡动10 s。10000 g，离心20 s (室温)。仔细弃全部上清，加蛋白酶抑制剂2μl，缓冲液B 400μl，混悬，冰浴1h，间以搅拌。超声去核酸，工作时间2s，间歇时间10s，功率200w。4℃，14 000 g，1h，吸取上清，分装。用Bradford 法测蛋白浓度。

　　2.7 细胞核蛋白的双向电泳将提好的细胞核蛋白样品分装，送公司进行双向电泳。

　　3．实验及结果分析

　　3.1 激光共聚焦检测凋亡素定位结果激光共聚焦荧光显微镜观察凋亡素转染24 及48 小时后，在肿瘤细胞与正常细胞的定位情况。转染24 小时后，凋亡素定位在肿瘤细胞和正常细胞的细胞核，无明显的凋亡形态特征变化。转染48 小时后，凋亡素从正常细胞核内出来在胞质中聚集，无凋亡形态特征变化；而仍定位于肿瘤细胞的核内，聚集，可以见到细胞核的染色质高度凝聚，细胞核裂解为碎块，边缘不清晰，产生凋亡小体，引起肿瘤细胞的特异凋亡。

　　3.2 双向电泳结果我们通过双向电泳进行初步分析，发现HepG2 与L02 细胞核蛋白表达存在差异。

　　4．讨论

　　凋亡素能够特异引起肿瘤细胞与转化细胞的凋亡，这种细胞凋亡是非P53 依赖的，而不能够导致正常细胞的凋亡。同时我们观察到，凋亡素在细胞内的定位与其凋亡功能密切相关。将凋亡素的基因转染进细胞，24 小时后，我们发现凋亡素无论在肿瘤细胞还是正常细胞，都定位在细胞核内，都不引起细胞的凋亡。48 小时后，凋亡素在肿瘤细胞核内聚集，行使凋亡功能，而凋亡素却从正常细胞的核内出来，在胞质内聚集，不能引起正常细胞的凋亡。于是我们推测，凋亡素行使凋亡功能与其在肿瘤细胞核内受到某种修饰，而停留在细胞核内有关。而这种修饰在正常细胞的核内是没有的，因此肿瘤细胞与正常细胞之间一定存在着某种蛋白表达的差异。

　　凋亡素包含两个分开的核定位信号（位置82-88，111-121），和一个CRM1 调节的核输出信号。有文献报道，当凋亡素进入肿瘤细胞核内后，其108 位的苏氨酸被磷酸化，抑制了CRM1 的活性，影响了凋亡素在肿瘤细胞内的核输出。而凋亡素在正常细胞内不被磷酸化，核输出信号依赖CRM1 使凋亡素从核内输出，在胞质内聚集成大的聚合体，而最终被其他蛋白所中和，丧失了诱导细胞凋亡的功能。

　　因此，我们可以推测在肿瘤细胞内存在着特异的磷酸激酶，或者其他某种能使凋亡素特异修饰的蛋白。

　　目前高通量的蛋白质组学研究方法已经成为了有力的手段，蛋白质质谱鉴定技术和生物信息学迅猛发展。高分辨率、高敏感性和高流通性的分离和分离后鉴定技术，结合准确、全面的数据库技术，使蛋白质组技术用于生物研究卓有成效。我们通过蛋白质组学的方法找到了肿瘤细胞HepG2 细胞和正常细胞L02 细胞核蛋白表达的差异，但是由于时间关系，没有对差异点进行质谱分析，鉴定，这是我们下一步的工作，以期望能够找到这个特异的蛋白，来完善凋亡素的机制研究。

【研究凋亡素参与正常细胞核蛋白表达差异】相关文章：

瘢痕成纤维细胞的钙网蛋白表达研究05-29

维生素C胶囊的制备工艺研究12-05

媒体参与企业社会责任治理的效应研究06-07

民事执行之参与分配制度研究06-06

对于体育锻炼态度、参与度与体育价值观的相关研究05-28