探讨肺康饮含药血清对人肺癌细胞
毕业论文研究表明，目前许多抗药物的抗肿瘤作用可能是通过诱导肿瘤细胞凋亡实现的［4］。药物对肿瘤治疗的1个重要途径就是诱导肿瘤细胞凋亡，传统的益气法和活血法在肿瘤的免疫治疗中体现出较好疗效［5］。肺康饮就是我们根据扶正祛邪的治疗原则，在多年临床实践基础上，采用益气养阴、清热解毒法研制而成的。经临床观察应用，对于中晚期非小细胞肺癌患者有1定疗效，可降低化疗对患者免疫功能的影响，改善患者的生活质量［2］。
最近10年来，肺癌的发病率逐年上升，尽管治疗方法不断改进，但5年生存率不足14%［1］。肺癌严重危害着人类身体健康，其发病率高，病死率高，目前临床尚无理想的治疗方法。临床研究表明，中药组方在治疗肺癌方面取得了较好的疗效，中医药是肺癌综合治疗的重要手段之1。肺康饮是由竹叶、桑叶等数味中药组成的中药复方，经临床观察对肺癌患者有1定的疗效［2］，但作用机制还不清楚。为此，本研究采用中药血清药理学方法孵育人肺癌NC-H446细胞株，以细胞生长抑制率及凋亡率为观察指标，以期深入探讨肺康饮抗肺癌的作用机制。
1 材料与方法
1.1 人肺癌细胞系
人非小细胞肺癌NC-H446细胞株由中国医科大学细胞室提供，我院实验中心细胞室保存。
1.2 主要试剂
RPMI1640培养液、胎牛血清为GIBCO公司产品；噻唑蓝（MTT）及2甲基亚砜（DMSO）为BBI公司产品； Annexin V细胞凋亡试剂（北京宝赛公司）。
1.3 主要仪器
美国SHELLAB2300型CO2细胞培养箱；日本Nikon倒置相差显微镜；美国Sfat自动酶标分析仪；美国FACScan流式细胞仪等。
1.4 实验方法
1.4.1 肺康饮含药血清的制备
肺康饮由竹叶、桑叶等数味中药组成。传统方法煎制，浓缩为100%。按照文献方法［2］按成人用量定容为65mL/d计算，按成人65kg体重剂量的10倍灌胃，即每100g大鼠灌1mL药汁，对照组给予相同剂量生理盐水。给药3d，末次给药后1～2h无菌条件下自心脏取血，离心分离血清，56℃水浴，30min灭活，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存备用。
1.4.2 分组与药物血清添加
分为正常血清对照组，肺康饮低剂量（5%）血清组、肺康饮中剂量（10%）血清组、肺康饮高剂量（15%）血清组。参照文献方法［2］制备药物血清温育液：①药物血清组：临用前将用药组大鼠血清加入RPMI1640培养液，浓度分别为5%、10%、15%。②对照组：对照组大鼠血清加入RPMI1640培养液，浓度10%。
1.4.3 细胞培养
将NC-H446细胞株常规培养于含10%热灭活小牛血清的RPMI1640培养液（含青链霉素各100IU/mL）中，于37℃、5% CO2培养箱内连续培养。
1.4.4 肺康饮含药血清对NC-H446细胞增殖的影响
取对数生长期的NC-H446细胞株以1.50×106个/mL的细胞浓度接种于96孔培养板内，每孔体积200μL,在37℃、5% CO2培养箱内培养24h换液。采用直接加入法，分别加入不同浓度（5%、10% 、15%）的含药血清和对照血清。每组设4个复孔。继续培养24h、48h后，培养板每孔加入50μL MTT（2mg/mL），同样条件继续孵育4h，吸弃上清，每孔加入100μL2甲基哑砜（DMSO）振荡混匀，于酶标492nm测定各孔的吸光度OD值，计算相应的细胞抑制率：
抑制率（%）=（1- OD实验组/ OD对照组）×100%
1.4.5 肺康饮含药血清诱导肺癌细胞凋亡表达的测定
将传代的NC-H446细胞接种于100mL培养瓶中，以含10%热灭活小牛血清的RPMI1640培养液置37℃、5%CO2孵育箱中培养；培养24h至对数生长期，弃培养液，分别加入含有不同浓度（5%、10%、15%）的含药血清及对照组血清的培养液各4mL，置培养箱中培养48h。收集48h含药血清培养的NC-H446细胞培养液，胰酶消化，PBS洗涤3次，置入10mL离心管中离心，4℃、1000rmp、10min，弃上清；加入70%乙醇4℃固定24h以上；上机前离心去除乙醇固定液，PBS清洗2次，加入100μL含钙PBS静置10min，加5μL Annexin V，10μL PI，避光反应15min，上机检测，以不含药血清处理的NC-H446细胞为阴性对照，计算相应阳性细胞表达率。
1.5 统计学方法
采用多因素方差分析法检测组间差异的显著性。所有统计学检验均应用SPSS11.5统计软件进行。
2 结果
2.1 肺康饮含药血清对NC-H446细胞增殖的影响
不同浓度的含药血清分别作用于NC-H446细胞株，分别于24h、48h采用MTT法检测各组血清对NC-H446细胞株增殖的抑制率。结果表明，各含药血清组对NC-H446细胞的增殖均有抑制作用，抑制作用呈1定的量效和时效关系，即随着含药血清浓度的增加，抑制率逐渐增加；同时随着作用时间的'延长，抑制率相应增加，见表1。表1 肺康饮含药血清对NC-H446细胞增殖的影响（略 ）注：与同1时点对照血清组比较△ P<0.05,△△ P<0.01；与同组24h比较▲P<0.05
2.2 肺康饮含药血清对NC-H446细胞凋亡的影响
不同浓度的含药血清分别作用于NC-H446细胞株，分别于24h、48h，应用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。结果显示：各含药血清组均可诱导NC-H446细胞发生凋亡，与对照组间差异有显著性，且诱导凋亡的作用具有1定的量效和时效关系，即随着含药血清浓度的增加，凋亡指数逐渐增加；同时随着作用时间的延长，凋亡指数也相应增加，见表2。表2 肺康饮含药血清培养24、48h后的细胞凋亡率（略 ） 注：与同1时点对照血清组比较△P<0.05,△△P<0.01；与同组24h比较▲P<0.05
3 讨论
细胞凋亡是指在正常生理情况下，为了整个生物体的更大利益，受伤或衰老的细胞通过1种程序性细胞死亡方式牺牲自己的过程。凋亡作为细胞死亡的1种重要形式，对维持机体正常发展和保证体内平衡有着重要调节作用。细胞凋亡紊乱、细胞周期异常导致肿瘤无限制增殖是肿瘤发生的重要原因之1［3］。
研究表明，目前许多抗药物的抗肿瘤作用可能是通过诱导肿瘤细胞凋亡实现的［4］。药物对肿瘤治疗的1个重要途径就是诱导肿瘤细胞凋亡，传统的益气法和活血法在肿瘤的免疫治疗中体现出较好疗效［5］。肺康饮就是我们根据扶正祛邪的治疗原则，在多年临床实践基础上，采用益气养阴、清热解毒法研制而成的。经临床观察应用，对于中晚期非小细胞肺癌患者有1定疗效，可降低化疗对患者免疫功能的影响，改善患者的生活质量［2］。
在我们开展的实验中，采用含药血清培养肿瘤细胞，以人非小细胞肺癌NC-H446细胞为研究对象，以促进肺癌细胞凋亡为作用靶点，应用MTT法和流式细胞仪观察肺康饮对NC-H446细胞的作用。发现肺康饮含药血清能够抑制肺癌细胞的增殖，MTT法显示肺康饮含药血清对肿瘤细胞的抑制作用呈时间和剂量依赖关系，即随着含药血清浓度的增加，抑制率逐渐增加；同时随着作用时间的延长，抑制率相应增加。流式细胞仪检测发现肺康饮含药血清具有诱导NC-H446细胞株凋亡的作用，并随着药物剂量的增大和作用时间的延长，其作用愈明显。由此可见肺康饮含药血清可能是通过诱导肿瘤细胞凋亡而达到抑制其增殖的目的。但该方剂是否会影响细胞其它方面的改变，究竟是复方在起作用，还是其中的某种有效成分，尚有待于进1步研究。
【参考文献】
1 Suh YA,Lee HY,Virmani A,et al.Loss of retinoic acid receptor Bete gene expression is linked to aberrant histone H3 acetylation in lung cancer cell linesd［J］.Cacer Res,2002,62(14):3945-3949
2 赵建清，李旺，张淑萍，等.肺康饮联合化疗治疗晚期非小细胞肺癌临床疗效观察［J］.中药药理与临床，2006，22（5）：27
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