论急性运动对骨骼肌mTOR信号通路的影响

时间：2024-10-14 19:17:29 其他毕业论文我要投稿

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摘　要:目的:研究急性运动或AICAR注射对mTOR及下游信号的影响,旨在探讨AMPK调控骨骼肌蛋白合成的机制。方法:52只雄性SD大鼠分为4组:安静对照组(n=8)、运动组(n=18)、生理盐水注射对照组(n=)、AICAR注射组(n=18)。运动速度26 m/min,坡度10%,时间60 min。运动和注射组分别在结束后即刻、1h、6 h和1 h、2 h、6 h取材。结果:运动后即刻、注射后1 h,mTOR Ser2448磷酸化(分别下降45%和38%)和4E-BP1 Thr37/46磷酸化均显著降低(分别下降34%和38%),运动后1 h和注射后2 h mTOR及4E-BP1开始增加,6 h达峰值。注射组S6K1 Thr389磷酸化水平在各时间点无显著变化,运动组均显著升高(分别增加42%、52%和57%)。结论:一体育论文网次性剧烈运动或AICAR注射导致蛋白合成的暂时抑制,其机制与AMPK下调mTORSer2 448及其下游信号4E-BP1 Thr37/46的磷酸化水平有关,但未发现S6K1 Thr389磷酸化水平的下调。

论急性运动对骨骼肌mTOR信号通路的影响

关键词:AMPK;mTOR;蛋白合成;骨骼肌

　　近年来,一些研究证实5′-一磷酸腺苷激活的蛋白激酶(5′- AMP activated protein kinase , AMPK)能抑制蛋白合成[1-2],其分子机制可能涉及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路[3]。AMPK通过何种机制调控mTOR信号通路目前还未阐明,初步的研究涉及mTOR信号通路上的多个分子如PKB、TSC2、mTOR、4E-BP1、S6K1等,但其作用的主要靶点还不清楚。急性运动或AICAR注射时,AMPK活性和mTOR信号通路的变化时程有什么特点?二者有什么样的关系?目前未见报道。本实验采用一次性运动、一次性AICAR注射方法,研究运动或AICAR对骨骼肌mTOR信号通路的影响,探讨AMPK抑制骨骼肌蛋白合成的分子机制。实验假设AMPK对蛋白合成的抑制涉及mTOR信号通路。

1　材料与方法

1.1　动物及分组

　实验动物:8周龄健康雄性SD大鼠,体重180~200 g,由北京大学医学部实验动物中心提供。昼夜节律人工控制光照(光照时间为07:00-19:00),环境温度(23±2)℃,动物自由取食及饮水。分组:52只雄性SD大鼠分为安静对照组(n=8)、运动组(n=18)、生理盐水注射对照组(n=8)、AICAR注射组(n=18)。表1　一次性AICAR注射或运动分组及体重g组别即刻取材1 h取材2 h取材6 h取材安静组240±10(n=8)运动组256±6(n=6) 252±11(n=6)—256±7(n=6)生理盐水注射组189±6(n=8)AICAR注射组—191±5 (n=6) 186±6(n=6) 188±7(n=6)投稿日期:2008-04-22基金项目:国家自然科学基金项目,批准号:30671013。通信作者:曾凡星。作者简介:张国华,副教授,博士,研究方向运动生理学。　　注射和运动方案:注射组以0·5 mg/g体重剂量在大鼠后肢大腿外侧皮下一次性注射AICAR溶液(浓度为65 mg/mL),生理盐水注射部位、剂量同AICAR。运动组以26 m/min的速度,10%的坡度进行一次性运动,时间为60 min。

1·2　取材方法

　运动组分别在运动后即刻、1 h、6 h取材,AICAR注射组分别在注射后1 h、2 h、6 h取材。取材前动物用20%的乌拉坦腹腔麻醉(0·8 mL/100 g体重)后,速取右后肢腓肠肌的白肌部分(位于腓肠肌外侧浅层)约200 mg,装入冻存管后投入液氮中保存,用于AMPK活性及mTOR、4E-BP1和S6K1磷酸化测定。

1·3　测试方法

　AMPK活性的测定采用放射性同位素方法,即根据AMPK使特异性肽底物SAMS(氨基酸序列为HMR-SAMSGLHLVKRR)磷酸化的原理,以[γ-32P]ATP作为磷供体检测酶的活性。按照ShinTerada[4]和Wim[5]提供的方法进行,AMPK活力单位: 30℃条件下,每分钟将1 nmol磷催化转入SAMS的酶量即1个单位酶活。mTOR、4E-BP1、P70S6K1磷酸化测定采用western blot方法。

1·4　统计处理

　全部统计学分析均采用SPSS13·0统计软件进行分析。计量资料用均数±标准差(X±SD)表示,计量资料的比较用单因素方差分析。显著性水平取P<0·05,非常显著性水平取P<0·01。

2　结　果

2·1　急性运动或AICAR注射AMPK活性的变化

　和安静对照组相比,一次大强度运动后即刻,腓肠肌AMPK活性升高180%(P<0·01),2 h组和1 h相比显著下降,但仍高于对照组(P<0·01),6 h恢复到对照组水平。和生理盐水注射对照组相比,一次AICAR注射后1 h,腓肠肌AMPK活性升高62%(P<0·01),2 h时基本恢复(与对照组相比无显著差异,P>0·05),6 h时完全恢复。表2　急性运动或AICAR注射腓肠肌AMPK活性的变化对照组(Control, n=8)即刻取材组(n=6)1 h取材组(n=6)2 h取材组(n=6)6 h取材组(n=6)急性运动3·18±0·29 8·60±0·75**5·41±0·63**$$- 3·12±0·34AICAR注射3·11±0·33 - 5·03±0·57**3·63±0·46 3·29±0·36
　　注:结果为平均数±标准差(X±SD)。**表示与对照组相比有非常显著性差异,P<0·01。$$表示与即刻相比,有非常显著性差异,P<0·01。

2·2　急性运动或AICAR注射mTOR、4E-BP1、P70S6K1磷酸化水平的变化　和安静对照组相比,一次大强度运动后各目标蛋白检测位点的磷酸化相对含量(和actin比较的相对灰度值)变化如下:mTOR Ser2448在运动后即刻下降45%(P<005),2 h开始升高,6 h时进一步升高(增加87%,P<0·05);4E-BP1 Thr37/46在运动后即刻下降34%(P<0·05),2 h时增加1·4倍(P<0·01),6 h时进一步升高(增加2·4倍,P<0·01);S6K1Thr389在各时间点分别增加42%、52%和57%(P<0·05)。

　　注:结果为平均数±标准差(X±SD)。*表示与安静对照组相比有显著性差异,P<0·05;**表示有非常显著性差异,P<0·01。和一次生理盐水对照组相比,一次AICAR注射后各目标蛋白检测位点磷酸化相对含量(和actin比较的相对灰度值)变化如下:mTOR Ser2448在注射后1 h下降38%(P<0·05),2h开始升高,但无显著性差异,6 h时进一步升高(增加97%,P<0·05);4E-BP1 Thr37/46在注射后1 h下降38%(P<0·05),2 h时升高61%(P<0·05),6 h时进一步升高(增加188%,P<0·01);S6K1Thr389在各时间点均无显著变化(P>0·05)。

3　分析与讨论

3·1　急性运动或AICAR注射激活骨骼肌AMPK信号

　5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(5′-aminoimidazole-4-carboxam-ide ribonucleoside, AICAR)是目前应用较多的AMPK激活剂,它是腺苷的类似物,进入细胞后在腺苷激酶的作用下转化为单磷酸核苷(ZMP),ZMP是AMP的类似物,它能够变构激活AMPK和其上游激酶AMPKK,后者继而激活AMPK,此过程并不引起细胞AMP、ADP和ATP水平改变[6]。本实验结果表明,以0·5 mg/g剂量一次性皮下注射AICAR能显著激活骨骼肌AMPK,注射后1 h AMPK活性增加61%(P<0·01),2 h时仍略高于安静水平17%(P>0·05),但无显著性差异,6 h恢复正常。一次性大强度运动后即刻AMPK活性较安静时增加1·8倍,此后持续下降,但1h时仍高于安静水平,6h时已完全恢复正常。虽然无法比较运动和AICAR激活AMPK的效应,毕竟运动强度和时间与药物浓度之间尚无法进行对应,但本实验结果表明运动和注射AICAR均能有效激活骨骼肌AMPK,且恢复时程基本一致。不过,从本实验结果来看,二者仍表现出一些差异。其一,大强度一次性运动明显强于AICAR以0·5mg/g的剂量注射对AMPK的激活程度(数据显示如此)。事实上,运动和AICAR激活AMPK的机制是不相同的,前者主要通过AMP和ATP的作,后者则通过ZMP的作用。ZMP虽然是AMP的类似物,但其激活AMPK的方式可能与AMP不同。有人认为ZMP可能作用AMPK的外部机制如激活糖原磷酸酶等其他AMP敏感酶,或是经腺苷受体和/或腺苷转运体发挥作用[7-8]。ZMP是否也象AMP一样,通过增加上游激酶对AMPKαThr172位点磷酸化而激活AMPK也不清楚,而且,AICAR增加ZMP的同时, ZTP亦见增长,并通过变构效应妨碍AMPK的完全激活。所以,ZMP的作用逊于AMP,这可能是AICAR的作用不如运动强烈的部分原因。其二,AICAR注射大鼠注射后2 h AMPK已恢复正常,而运动大鼠在运动后2 h仍高于安静水平。所以,AICAR对运动的效应模拟也不是完全一致的。

3·2　一次AICAR注射或运动对mTOR信号通路的影响

　不同运动形式对骨骼肌蛋白代谢的影响非常复杂。高频电击、抗阻运动能促进蛋白合成,造成净体重增加,剧烈或长时间耐力运动对蛋白代谢可能具有抑制作用。Bolster等发现,使用AICAR孵育使大鼠肝细胞蛋白合成速率明显下降[1]。使用AICAR诱导C2C12肌管AMPK激活发生于注射后第15 min,并在随后持续上升,相应地,在第15、30和60 min蛋白合成速率分别下降为注射前的90%、70%和63%[9]。实验表明,AMPK抑制肌细胞蛋白合成的机制涉及对mTOR信号通路的下调。本实验发现,一次AICAR注射后1 h,mTOR Ser2448、4E-BP1 Thr37/46磷酸化水平均下降38%,2 h时开始升高(分别
增加26%、61%),6 h时达峰值(分别增加97%和188%),但S6K1 Thr389磷酸化水平在各时间点无显著变化,表明一次注射AICAR能显著抑制骨骼肌mTOR信号通路,其作用靶点涉及mTOR Ser2448和4E-BP1 Thr37/46磷酸化水平的抑制,但不涉及S6K1 Thr389磷酸化水平的抑制。结合AICAR注射后AMPK活性的变化规律分析,当AMPK活性最高时,mTOR及其下游信号磷酸化水平最低,随着AMPK活性的逐渐下降,mTOR信号通路磷酸化水平逐渐上升。因此,ATCAR注射对mTOR信号通路的抑制应该是AMPK依赖性的本实验还发现,一次性大强度运动后即刻,mTOR Ser2448和4E-BP1 Thr37/46磷酸化水平分别下降45%和34%,2 h时开始升高(分别升高13%和1·4倍),6 h时达峰值(分别升高87%和2·4倍);S6K1 Thr389磷酸化水平在运动后即刻即见上升,并持续至运动后6 h(分别增加42%、52%和56%,P<0·05),表明一次性大强度运动能显著抑制mTOR及下游4E-BP1信号,但不能抑制S6K1,运动后恢复期蛋白合成增加。结合AMPK活性的变化情况看,运动后即刻,AMPK活性最大,此时mTOR磷酸化水平最低,而运动后6 h,随着AMPK活性的恢复,mTOR磷酸化水平达到峰值,表明运动后mTOR及下游信号分子的激活与AMPK有关。但运动后1 h,mTOR、4E-BP1和S6K1信号磷酸化开始增加,而此时AMPK活性仍显著高于安静水平,这似乎令人费解。本课题组对此的理解是,AMPK并非控制mTOR信号通路的唯一机制,运动时可能还有其他机制同时被激活,如MEK/ERK/P90RSK信号通路,该通路和AMPK的作用相反,能促进蛋白合成,运动中AMPK的作用占优势。运动后一定时间尽管AMPK仍维持激活状态,但随着其活性的下降,其他激活mTOR通路的机制可能开始占据优势,从而无视AMPK对mTOR通路的抑制效应。所以,运动后mTOR信号通路的激活可能部分与非AMPK依赖性机制的作用有关。AMPK作用于mTOR信号通路的靶点存在争议。首先,AMPK是否能使mTOR去磷酸化而降低其活性?一些研究认为,AMPK能直接或经mTOR的分子伴侣raptor间接作用于mTOR而抑制其活性。1)直接磷酸化mTOR Thr2446位点,这使得另一位点Ser2448的磷酸化被抑制,而Ser2448位点是PKB信号的作用靶,其磷酸化是激活mTOR的最主要方式,所以,AMPK磷酸化mTOR Thr2446位点后,通过抑制PKB介导的Ser2448位点的磷酸化而间接抑制mTOR的活性[10];2)通过影响mTOR的分子伴侣raptor而调节其活性。从本研果来看,无论是AICAR注射还是跑台运动都导致了mTOR在Ser2448位点的去磷酸化,似能同意AMPK直接或通过PKB间接抑制mTOR的观点。其次,AMPK是否能去磷酸化4E-BP1S6K1?目前存在三种不同的看法:1) AMPK对S6K1和4E-BP1的磷酸化水平均有作用。有研究发现,使用AICAR诱导AMPK激活后能使raptor-mTOR络合物变成关闭的、活性下降的形式,导致其磷酸化下游靶4E-BP1和S6K1的能力下降,从而抑制mTOR信号通路[9];2) 4E-BP1是AMPK的主要作用靶。Hans等的研究发现,人体一次性抗阻运动后即刻AMPK活性升高并持续至1 h,蛋白合成速度明显下降,运动后1~2 h开始升高。同时,运动后即刻4E-BP1磷酸化下降,1~2 h开始升高,而TSC2、PKB、mTOR、eEF2均无显著变化,因此认为AMPK主要通过对4E-BP1的去磷酸化而抑制蛋白合成[2]。David等的研究亦得到类似结果[11];3) S6K1是AMPK的主要作用靶。Gustavo等发现,一次高频电击使大鼠胫骨前肌S6K1磷酸化水平在刺激后3 h显著增加并持续至6 h,并且AICAR能以剂量和时间依赖方式抑制HCE-T细胞S6K1活性[12]。本实验结果支持4E-BP1是AMPK的主要作用靶点的观点,因为无论是AICAR注射还是跑台运动均未发生骨骼肌S6K1的去磷酸化。另外,AMPK是否能控制mTOR的上游信号?虽然本研究未涉及上游指标,但从文献报道可以得出一些认识。有研究表明,AMPK在两个位点(Thr1227和Ser1345)直接磷酸化并激活TSC2,通过使这两个位点突变证明磷酸化事件增加了TSC复合体抑制mTOR通路的能力[13]。人们认为TSC2抑制mTOR的活性的分子机制可能涉及小GTP酶Rheb。不过,部分研究不支持AMPK对TSC2的调节作用[2,11]。AMPK是否能影响mTOR的另两种上游信号PI3K和PKB亦存在争议。有研究发现在C2C12肌管中使用AICAR导致IRS-1在Ser789位点磷酸化增加,而该位点的磷酸化导致与IRS-1相关的PI3K活性下降[14]。另一在体研究发现AICAR使骨骼肌PKB在Ser473位点磷酸化水平下降[15],然而,在培养的HCE-T细胞中,使用AICAR未见到这种影响[16], Cheng等发现AICAR不能通过PKB介导mTOR信号通路功能[17]。本研究结果表明,AICAR和运动无论是对AMPK的激活,还是对蛋白合成的抑制,都表现出较好的相似性。大量的运动(包括抗阻、电击和跑台运动的人体和动物模型)研究表明,抗阻或剧烈耐力运动中,蛋白合成被抑制,运动后恢复期这种抑制被解除,随后进入恢复性增加阶段,恢复过程可能持续到运动后24~48 h[11]。所以,运动对骨骼肌蛋白合成的影响是运动中的抑制和运动后恢复性增加两过程的中和。本实验对AICAR注射效果的研究表明,mTOR及下游信号4E-BP1被短暂抑制,随后磷酸化水平增加,这和运动组的观察结果是一致的。不过,AICAR注射未能影响S6K1的磷酸化水平,而运动后即刻、1 h和6 h均见S6K1磷酸化水平增加,尚不能解释造成这种不一致的原因,但至少再次表明AICAR并不能完全模拟运动效应。总的来看,目前对AMPK与mTOR信号通路关系的研究主要集中在mTOR及下游信号上,多数学者同意AMPK能通过磷酸化事件调节mTOR和4E-BP1分子活性,当然,这种影响可能是直接也可能是间接的。S6K1也可能是AMPK的另一作用靶,但本研究和部分报道未支持这一观点。AMPK与mTOR信号通路上游分子PI3K、PKB、TSC1/2等的关系的研究材料目前还不丰富,且结论也不一致,这是本研究领域的今后需要加强的方向。由于AMPK的激活及对mTOR信号通路的作用在不同肌纤维类型(如快慢肌)、不同运动方式(如力量与耐力)、不同研究对象(如人和啮齿动物)及不同研究方法(如等:急性运动或AICAR注射对骨骼肌mTOR信号通路的影响在体和离体)中并不相同,这可能是导致一些研究结论不一致的部分原因。

4　结　论

1)一次性剧烈运动或AICAR注射均能激活骨骼肌AMPK,并导致蛋白合成的暂时抑制,其机制与AMPK下调mTOR Ser2448及其下游信号4E-BP1 Thr37/46的磷酸化水平有关,但未发现S6K1 Thr389磷酸化水平的下调;

2)一次性剧烈运动后1h或AICAR注射后2 h,骨骼肌蛋白合成加速,6 h时达峰值,其机制与mTOR Ser2448、4E-BP1Thr37/46和S6K1 Thr389磷酸化水平升高相关,但AICAR和运动对S6K1 Thr389磷酸化水平的影响存在差异。

3)一次性剧烈运动或AICAR注射后1~6 h,AMPK信号的下调与mTOR信号通路的上调时程基本一致,但不完全同步,表明运动后蛋白合成的恢复与AMPK信号的下调有关,但也可能部分涉及其他激活mTOR的机制。

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