黄连生物碱成分的HPLC DAD MS 解析论文
黄连为毛茛科植物黄连( Coptis chinensis Franch) 、三角叶黄连( Coptis deltoidea C. Y. Cheng et Hsiao) 或云连( Coptis teeta Wall) 的干燥根茎黄连中的主要活性成分原小檗碱类生物碱为季铵类生物碱。采用RP - HPLC 测定黄连中生物碱类成分含量时，小檗碱类在C18为填料的色谱柱上保留行为较差，通常需在流动相中加入离子对试剂改善保留行为，常用的离子对试剂为十二烷基硫酸钠( SDS)，SDS 有分子量大、难挥发不适用于LC - MS 分析、易析出堵塞管路等缺点，有文献在用三乙胺调节流动相pH 值后LC -MS 法分析黄连中生物碱，但三乙胺进入质谱系统后残留时间较长，很难清除。本实验用分子量小、溶解性好、易挥发、质谱中易清除的乙酸铵做HPLC 流动相中的离子对试剂，建立了同时测定黄连中3 个主要生物碱类成分的方法。测定了5 批黄连药材的含量，并采用HPLC - ESI - MS 联用方法鉴定了黄连中的主要生物碱类成分。以期为黄连及含黄连制剂质量控制提供参考。
1 材料与仪器
1. 1 试药盐酸小檗碱对照品和盐酸巴马汀对照品( 均购于中国药品生物制品检定所，批号分别为110713 - 200609 和110732 - 200506) ，盐酸黄连碱对照品( 南京泽郎科技有限公司，批号200803) ; 乙腈为色谱纯; 乙酸铵、冰乙酸、甲醇为分析纯; 二纯水为MilliQ 纯化水系统制备; 黄连药材( 20101001) 、黄连药材( 20101201) 分别由天津天士力现代中药资源有限公司采购自重庆石柱，经中国药科大学冯锋教授鉴定分别为黄连( Coptis chinensis Franch) 和三角叶黄连( Coptisdeltoidea C Y Cheng et Hsiao) ; 姜黄连( 20101202) 、酒黄连( 20101203) 、萸黄连( 20101204) 三种炮制品为黄连药材( 20101001) 在天津市兴达中药材加工厂炮制加工而成。
1. 2 仪器BP - 110S 型电子天平( Sartorius) ，Milli -Q 超纯水系统( Millipore) ，1100 型高效液相色谱仪( Agilent) ，LC /MSD Trap system( Agilent) ，Zorbax SB -C18( 250 mm × 4. 6 mm，5 μm) 色谱柱( Agilent) ， IKA -MF10 型粉碎机( IKA) 。
2 方法与结果
2. 1 色谱条件流动相A 为乙腈，流动相B 为20mmol /L 乙酸铵- 0. 5%醋酸水溶液，流速1. 0 ml /min，梯度洗脱: 0 min ( A 10%) →10 min ( A 15%) →15 min( A 28%) →30 min ( A 32%) →35 min ( A 32%) ，分析时间为35 min，每次进样前用A 10%平衡10 min，柱温30 ℃，检测波长为345 nm。
2. 2 溶液制备
2. 2. 1 对照品溶液配制精密度称取对照品适量，加甲醇配制成每ml 含42. 0 μg 盐酸黄连碱、44. 8 μg 盐酸巴马汀和50. 2 μg 盐酸小檗碱的混合对照品溶液。
2. 2. 2 供试品溶制备黄连药材或饮片粉碎后过二号筛，精密称取约0. 20 g 药材粉末，置具塞锥形瓶内，精密加入50 ml 甲醇- 盐酸( 100∶ 1) 溶液，称定重量，密塞，超声30 min( 功率250 W，频率40 kHz) ，放冷，加甲醇- 盐酸( 100∶ 1) 溶液补足失重，摇匀，滤过，精密移取5. 0 ml 续滤液至50 ml 量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，用微孔滤膜( 0. 22 μm) 滤过，即得。
2. 3 系统适应性试
验分别吸取混合对照品、供试品溶液10 μl，按“2. 1”项下色谱条件检测。对照品和供试品的色谱图。结果显示，盐酸黄连碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱色谱峰的理论塔板数均不低于34 927; 供试品中盐酸黄连碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱与相邻色谱峰的分离度分别为2. 87、6. 49 和3. 85，三个成分的分离度良好。
2. 4 标准曲线的制备
分别精密吸取混合对照品溶液1、2、5、10 和20 μl，按“2. 1”项下色谱条件检测，以对照品进样量( X，μg) 为横坐标，峰面积( Y) 为纵坐标，进行线性回归，线性方程。
2. 5 精密度试验精密
吸取混合对照品溶液10 μl 按“2. 1”项下色谱条件检测，重复进样6 次，6 次进样峰面积的RSD 黄连碱为0. 87%，巴马汀为0. 91%，小檗碱为0. 91%; 出峰时间的RSD 黄连碱为0. 02%，巴马汀为0. 02%，小檗碱为0. 03%，方法精密度良好。
2. 6 稳定性试验
称取黄连粉末( 批号20101001)0. 2 g 按“2. 2. 2”项下方法制得供试品溶液，分别于0、2、4、8、16 和24 h 进样10 μl，6 次进样峰面积的RSD黄连碱为1. 21%，巴马汀为1. 13%，小檗碱为1. 06%，黄连供试品溶液24 h 内稳定性良好。
2. 7 重复性试验
取黄连粉末( 批号20101001) 6 份，按上述供试品制备方法和HPLC 方法检测，6次含量测定得到3 个成分含量的RSD 黄连碱为2. 34%，巴马汀为1. 90%，小檗碱为1. 33%。
2. 8 加样回收率
试验精密称取对照品适量，加甲醇- 盐酸( 100∶ 1) 溶液配置成每ml 含0. 055 2 mg 盐酸黄连碱、0. 036 2 mg 盐酸巴马汀和0. 128 6 mg 盐酸小檗碱的加标对照品溶液，精密称取约0. 10 g 黄连药材粉末加入锥形瓶，精密加入上述加标对照品溶液50ml，按“2. 2. 2”项下方法从“称定重量，密塞”起制备加标供试品溶液，平行6 份，按上述方法检测，计算回收率。盐酸黄连碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱的平均回收率依次为98. 7%、97. 6% 和102. 3%，RSD 依次为2. 47%、2. 10%和1. 62%。
2. 9 样品测定
取黄连药材两批，3种黄连炮制品各一批，每批样品平行两份，按“2. 2. 2”项下方法制备供试品溶液，按“2. 1”项下色谱条件检测。黄连药材及黄连三种炮制品的生物碱含量测定结果，可见各样品的生物碱含量差异较小，炮制对样品中生物碱含量无明显影响。
2. 10 LC - DAD - ESI - MS 分析方法
液相分析条件同“2. 1”项，DAD 检测器记录190 ～ 400 nm 紫外吸收光谱; 离子化方式为电喷雾离子化( ESI) ，干燥气体N2，流量12 L /min，雾化器压力50 psi，脱溶剂干燥温度350 ℃，质谱检测器为离子阱检测器( Ion - Trap) ，扫描范围: m/z 50 ～ 1 100。
2. 11 LC - MS 检测样品处理
称取黄连粉末10 g，加入150 g 纯化水，称定重量，加热回流提取30 min，冷却至室温，加入纯化水补足失重，滤纸过滤，精密移取续滤液1 ml 置50 ml 量瓶中，加纯化水定容至刻度，用微孔滤膜( 0. 22 μm) 滤过，即得样品溶液。取样品溶液10 μl 按“2. 10”项下方法检测。
2. 12 LC - DAD - ESI - MS 检定黄连中成分
结果样品的紫外吸收色谱图和总离子，本实验中的HPLC 方法对黄连中物质的分离度和峰形良好。对主要色谱峰190 ～ 400 nm 的吸收特征分析显示黄连中7 个峰分为两类，1号峰( λmax = 270，305 nm) 吸收特征与木兰花碱的吸收特征相似; 2 ～ 7 号峰分别在255 ～ 270 nm 和345 ～ 360 nm 之间有两个最大吸收带，吸收特征与小檗碱相似，见图4。根据各高效液相色谱峰的紫外吸收和质谱裂解规律，从7 个色谱峰中鉴别出8 个成分，包括一个阿朴啡类生物碱和7个原小檗碱类生物碱。讨论2010 版《中国药典》黄连含量测定项中流动相需添加0. 4% SDS 做离子对试剂，SDS 在流动相中的溶解性对温度和有机相比例敏感，温度降低或流动相比例发生变化都有可能析出堵塞管路，SDS 具有对C18填料有改性作用、难挥发、不适合LC - MS 分析等局限。本实验使用分子量小、溶解度好、易挥发的乙酸铵代替SDS 改善生物碱的分离度和峰形，可以避免以上问题。
实验中比较了等度洗脱与梯度洗脱，梯度洗脱分离度较好; 还比较了20 mmol /L 醋酸铵，与100mmol /L醋酸铵的区别，两个浓度的分离度和线性范围无显著区别，所以选择盐浓度较低的'20 mmol /L 醋酸铵作为离子对试剂，使用梯度洗脱方法。本实验建立的方法能同时测定黄连中小檗碱、巴马汀和黄连碱3 个主要成分的含量。方法学考查结果显示，该方法稳定、可靠，可用于黄连及黄连炮制品质量的控制和评价。实验中还用HPLC - MS 对黄连样品进行了分析，通过质谱数据得到的峰归属结果与标准品比对相附，黄连药材样品中5、6、7 号峰为纯物质峰，进一步证明了本实验中色谱方法的准确性。相对于前人用醋酸- 醋酸铵改善黄连生物碱分离效果的研究，本方法分离度和峰形均有较大的改善，并测定了含量相对较多的黄连碱的含量。
本实验的方法比2010 版《中国药典》中黄连项少测定了一个表小檗碱成分; 但小檗碱、巴马亭和黄连碱均为黄连中含量较多的生物碱，3 个生物碱的含量之和占了黄连生物碱中的大部分，控制这3 个成分的含量也能在很大程度上保障黄连及含黄连制剂的质量。并且有多数含黄连的复方制剂在黄连生物碱中只需要控制小檗碱的含量。本实验的方法有很大的应用空间。
【黄连生物碱成分的HPLC DAD MS 解析论文】相关文章：
6.了解咖啡的成分