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浅析蜡状芽孢杆菌生物强化反硝化脱氮论文
生物强化技术是向传统的生物处理系统中引入具有特定功能的微生物，提高有效微生物的浓度，增强对难降解污染物的降解能力，提高其降解速率，并改善原有生物处理体系对目标污染物的去除效能。目前，生物强化技术应用最为普遍的方式是直接投加对目标污染物具有特效降解能力的微生物，当原处理系统中不含高效菌种时，如果投入一定量的高效菌种，则可有针对性地去除废水中的目标污染物； 当原处理系统中只存在少量高效菌种时，投加高效菌种后，可大大缩短微生物的驯化时间，加快系统的启动，增强系统的耐负荷冲击能力和稳定性。笔者从启动成功并稳定运行的反硝化反应器中富集分离出1 株高效反硝化功能菌，在鉴定该菌株后进行扩大培养，采用直接投加功能菌法进行生物强化研究，对比考察了普通工艺与生物强化工艺从启动到稳定运行的反硝化脱氮效果。
1 试验材料与方法
1。 1 试验装置
试验装置。采用序批式反应器（ 有效容积为15 L） ，考察硝酸盐为电子受体的反硝化脱氮运行效果。瞬时进水，通过搅拌器使泥水混合均匀，在运行期间保持反应器较好的厌氧/缺氧状态。试验用活性污泥取自某污水处理厂的沉淀池，该污泥具有初步的脱氮能力，活性污泥不进行培养驯化直接投入反应器，以厌氧/缺氧方式启动运行，反应器每天运行3 个周期，每个周期运行8 h，其中厌氧180 min、缺氧260 min、排泥排水40 min。r每周期开始瞬时加入含碳有机合成物5 L，缺氧期开始用恒流泵加入硝酸钠溶液5 L，硝态氮浓度从启动时的40 mg /L 逐渐增大直到稳定运行。系统MLSS 约为3 000 mg /L，HRT 为16 h，SRT 为30 d，pH 值控制在7。 0 ～ 8。 0。原则上当NO —3 — N 去除率> 90% 时，进水NO —3 — N 负荷正常以20 mg /L 递增，同时兼顾出水水质的稳定性。反应器运行过程中，分析检测运行参数，以便判断反应器运行状况并对其参数作相应调整。试验对比普通生物脱氮工艺和生物强化脱氮工艺的运行状况，每周期监测进出水NO —3 — N、NO —2 — N 浓度，每天从3 组数据中选择效果最好的一组作为当日的代表数据。
1。 2 试验水质
进水采用人工合成污水，水质成分如下： 葡萄糖（ COD） ，NaNO3（ NO —3 — N） ，KH2PO4为6 mg /L，CaCl2为10 mg /L，MgSO4·7H2O 为90 mg /L，NH4Cl（ NH +4 — N） 为20 mg /L，微量元素溶液为2 mL /L。微量元素成分如下： CuSO4·5H2O 为30 mg /L，KI为180 mg /L，MnCl2·4H2O 为60 mg /L，NaMoO4·2H2O 为60 mg /L，ZnSO4·7H2O 为120 mg /L，CoCl2·6H2O 为150 mg /L，EDTA 为10 g /L。其中COD、NO —3 — N 浓度随工艺运行逐步递增，基本原则为COD ∶ NO —3 — N = 4 ∶ 1，NaNO3（ NO —3 — N） 在缺氧期加入。厌氧期进水pH 值为7。 8 ± 0。 2，缺氧期进水pH 值为7。 2 ± 0。 2，以NaHCO3或HCl 调节pH 值。普通装置和生物强化装置，除进水NO —3 — N、COD 浓度不同外，其余运行条件全部相同。
1。 3 分析项目与方法
COD： COD 快速测定仪； 硝酸盐： 紫外分光光度法； 亚硝酸盐： N — （ 1 — 萘基） — 乙二胺分光光度法；pH 值： 玻璃电极法。
1。 4 生物强化菌种来源
生物强化反硝化试验菌种分离自前期稳定运行的反硝化脱氮污泥。优选得到的高效功能菌斜面保存备用。
1。 4。 1 菌种分离培养基
2。 0 g 的KNO3，5。 0 g 的葡萄糖，1 g 的K2HPO4，1g 的KH2PO4，0。 2 g 的MgSO4·7H2O，15～ 20 g 的琼脂，1000 mL 的蒸馏水，pH 值为7。 2 ～7。 5， 121 ℃条件下灭菌20 min。
1。 4。 2 菌种优选
将初选出的菌株扩大培养后，无菌高速冷冻离心分离，等量接种到装有200 mL 试验用水的静态试验装置进行摇床培养，定时取样，测定NO —3 — N、NO —2 — N 浓度变化，比较其反硝化能力。由于所筛菌株为后续生物强化辅助技术提供菌源，所以静态试验水质结合反应器实际运行情况，进一步提高硝酸盐浓度，以筛选出脱氮能力强的功能菌。水质如下： 葡萄糖（ COD） 为1 000 mg /L，NaNO3（ NO —3 — N） 为400 mg /L，其余成分同1。 2 节。
1。 4。 3 菌株鉴定
对优选出的代表菌株进行其单一菌种的相关特性研究[5]，在进行形态观察及生理生化试验的基础上，进行16S rDNA 的序列测定，从分子生物学的角度进一步鉴定其属种。
1。 5 生物强化研究
本试验为生物强化技术进行反硝化脱氮是否可行的初步探讨，所以采用操作较为简单的活化菌液直接投加。每次提高进水NO —3 — N 负荷时投加生物强化优势菌，投加时先将斜面保存的纯种优选菌株活化后进行扩大培养，再将获得的扩大培养菌液无菌高速冷冻离心分离，最后用无菌水将离心物洗出变成纯菌液。菌的含量为108 ～ 109 CFU/mL，每次按处理水量体积的2%投加。
2 结果与讨论
2。 1 功能菌筛选结果
通过筛选，有7 株菌对目标物具有良好的去除效果，该7 株菌分别暂命名为F5Y、FC、FZ、FC1、FRB、FH、FH2。，在电子受体NO —3 — N 浓度为400mg /L 的条件下，培养1 d 后，各菌株对NO —3 — N 的去除能力有很大差异，效果最突出的是FC1 和FH2，对硝酸盐的去除率分别为87。 5% 和80%，同时，这两株菌对亚硝酸盐的积累也很少，硝酸盐很快被代谢掉。第3 天硝酸盐就未被检出，亚硝酸盐含量也很低，第4 天亚硝酸盐全部被代谢。菌株FC最终对硝酸盐的去除效果也很好，期间亚硝酸盐的积累现象不明显，但反应周期较前两株菌的要长。通过对比，菌株FC1、FH2 可以将初始浓度为400mg /L 的NO —3 — N 几乎全部还原，从亚硝酸盐的还原情况可知，它们对NO —3 — N 的去除建立在将其转化为气态产物之上，应该具有完整的反硝化酶系，从而表现出了较强的脱氮能力。综合考虑NO —3 — N的去除率、去除速率以及NO —2 — N 的积累情况，选取菌株FH2 进行后续的研究，该菌株对400 mg /L的NO —3 — N 的去除率可达100%，且处理时间短，反应过程中基本无NO —2 — N 的积累，作为生物强化处理高浓度氨氮废水的菌源，应具有较好的应用性。
2。 2 生物强化菌株的鉴定结果
2。 2。 1 菌株FH2 的形态观察及生理生化试验结果
对优选菌株FH2 进行形态观察，结果显示，菌体形态： 杆状； 菌落形状： 不规则； 隆起形状： 扁平； 边缘形状： 毛玻璃状； 颜色： 淡黄； 透明程度： 不透明； 粘稠度： 不粘。对其进行生理生化试验，结果表明，革兰氏染色、芽孢染色、异染颗粒染色、鞭毛染色、硝酸盐还原、葡萄糖发酵试验、触媒试验、V。 P 试验均呈阳性，荚膜染色呈阴性，兼性厌氧。
2。 2。 2 16S rDNA 的序列测定和分析结果
为了进一步确定菌株FH2 的属性，对其进行了16S rDNA 序列测定。将测得的序列用Sequcecher软件进行拼接，去掉载体序列以及重复序列，得到16S rDNA 全序列。全序列以BLAST 软件在Gen—Bank 中进行相似性检索，得到与菌株序列最相近的菌株，有6 种菌的同源性达到99%。综合形态观察、生理生化试验和16S rDNA 的序列测定结果，鉴定菌株FH2 为蜡状芽孢杆菌（ Bacillus cereus） 。
2。 3 反硝化脱氮工艺的运行效果
为普通反硝化脱氮工艺和生物强化反硝化脱氮工艺的运行效果对比。由图3 （ a） 可见，在NO —3 — N 浓度为40 mg /L 的条件下启动普通反硝化脱氮反应器，由于活性污泥本身有一定的脱氮能力，第1 天对NO —3 — N 就有少量的去除，在前6 d 出水NO —3 — N 浓度呈逐渐减少的趋势，并且NO —2 — N 没有形成大量积累，说明活性污泥对进水NO —3 — N 已逐步适应； 第7 天开始出水NO —3 — N 浓度明显减少，此时NO —2 — N 浓度较前一天升高，这可能是因为微生物对NO —3 — N 的降解较快，但还未及时将生成的NO —2 — N 转化，第7 天脱氮率达到76。 65%，反为了稳定微生物的反硝化效果，普通脱氮反应器在进水NO —3 — N 为40 mg /L 的条件下继续运行了3 d，反硝化效果进一步提升，接近100%。在后续提高进水NO —3 — N 负荷的过程中，每次在提高进水负荷当天的出水浓度均波动较大，表明每次提高负荷均对微生物有一定冲击，且微生物的数量可能还暂时不能满足更高负荷的要求。在进水NO —3 — N浓度为60 ～ 160 mg /L 时，系统对进水负荷提高的适应速度较快，基本上从第3 天开始出水水质就开始好转，第4 ～ 5 天脱氮率达90% 以上，出水NO —3 — N浓度较低； 在进水NO —3 — N 浓度提高到180 ～ 220mg /L 时，对总氮的去除率影响较小，最终脱氮率均可达到90%以上，但由于进水浓度较高，使得出水浓度也较高； 当进水NO —3 — N 浓度提高到240 mg /L时，对微生物出现了较大的抑制作用，从第5 天开始出水水质逐渐好转，在该负荷下一共运行了10 d，最终脱氮率为95。 53%。为了探究该反应器的进水NO —3 — N 负荷极限，将进水NO —3 — N 提高到260mg /L 后继续运行了9 d，在此过程中，脱氮率一直在70%左右，出水NO —3 — N > 60 mg /L、NO —2 — N > 1。 5mg /L。因此，为了保证出水效果，普通反硝化脱氮工艺的进水NO —3 — N 浓度不宜超过240 mg /L。生物强化工艺在启动阶段，
第1 天没有明显的效果，与普通工艺差别不大，但从第2 天开始便有了较好效果，第4 天处理效果很明显，脱氮率达到84。 34%，出水NO —3 — N 为5。 45 mg /L、NO —2 — N 为0。 814 mg /L，反应器启动成功，启动时间较普通工艺有明显的缩短。当进水NO —3 — N 在60 ～ 120 mg /L 时，每次20 mg /L 的进水NO —3 — N 提高量对工艺运行影响极小，微生物很快就能适应，达到理想去除率的时间比普通工艺减少1 d 以上，所以在后续提高负荷时每次提高40 mg /L。在生物强化条件下，能达到理想脱氮效果的进水NO —3 — N 浓度最高为340 mg /L，进一步提高到380 mg /L 时出现了与普通工艺相似的情况，即使进一步投加生物强化菌也未得到改善。在两个反应器中，出水NO —2 — N 浓度一直较低，没有出现积累，说明系统对NO —3 — N 的去除是建立在将其转化为气态产物之上的。对知，生物强化工艺明显缩短了系统启动周期，在提高进水负荷时，适应时间短、适应性强，所能承受的最高进水NO —3 — N 浓度比普通工艺提高了100 mg /L，反硝化脱氮能力得到明显增强，表明采用该菌（ 蜡状芽孢杆菌） 进行生物强化反硝化脱氮能缩短微生物培养驯化时间，迅速提高生物处理系统中微生物的浓度，提高处理效率。
3 结论
① 从稳定运行的反硝化装置中优选出代号为FH2 的高效反硝化功能菌株，经鉴定该菌株为蜡状芽孢杆菌。在静态试验中，该菌在NO —3 — N 浓度为400 mg /L 条件下的脱氮率高达100%，并且代谢速率快，基本没有亚硝酸盐的积累，表现出了很强的脱氮能力。
② 与普通反硝化系统相比，投加FH2 菌的生物强化系统的启动时间明显缩短，在进水负荷提高时，适应时间更短、适应性更强，在达到理想脱氮率时所能承受的最高进水NO —3 — N 浓度为340 mg /L，比普通系统提高了100 mg /L，系统的反硝化脱氮能力得到明显提高。
③ 分离得到的蜡状芽孢杆菌本身的反硝化能力很强，且有芽孢的微生物具有很强的抗逆性，在进行生物强化应用过程中可抵抗外界不良环境，适应性强，易存活，所以将该菌作为菌源进行生物强化反硝化脱氮具有很强的应用性。
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