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鼠源抗柑橘溃疡病菌Fab抗体库的构建
1 引言
柑桔溃疡病是由地毯草黄单胞杆菌柑桔致病变种( Xanthomonas axonopodis pv. citri) 引起的一种国内外重大检疫性病害，给世界柑桔产业带来了巨大经济损失。病菌主要随罹病种苗等繁殖材料远距离传播，生产上常用的铜基杀菌剂和抗生素制剂对其防效不佳[1]，探索柑桔溃疡病的防治新途径在目前和将来都具有重大意义。基因工程重组单抗兼具治疗和诊断双重功能，利用抗原-抗体特异性结合原理，可用于人类疾病、植物病害的诊断、治疗和预防。
近年来发展起来的噬菌体抗体库技术使人们可以绕开细胞杂交瘤技术，直接从基因水平制备特异性单链抗体，由此开创了简便、快速生产基因工程抗体的先河，被认为是继杂交瘤技术后抗体生产技术的又一次革命[2,3]。20 世纪80 年代中期，Smith[4] 等提出了噬菌体展示技术，到90 年代初，Winter 等在前人的研究基础上创建了噬菌体抗体库技术，将噬菌体展示技术应用到抗体工程领域，彻底改变了制备抗体的传统途径，使抗体技术进入到了基因工程抗体时代。近年来噬菌体抗体库技术已经成功应用于医学研究及疾病诊断方面，但应用在植物病害方面研究的报道却寥寥无几[5,6]。Fab 抗体是由抗体轻链片段及重链的Fd 段组成的，与单链抗体ScFv 相比，具有稳定性更好的特点，且可直接在大肠杆菌中表达有活性的抗体，制备简单，省去了复性等繁琐的步骤。本研究采用噬菌体抗体库技术，以经过多次免疫的小鼠脾细胞mRNA 为基础，扩增出抗体轻链及重链Fd 段分别连接到噬粒载体中构建噬菌体抗体库，为后面的研究奠定基础。
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 实验动物
6～8 周龄BALB/c 小鼠4 只，均购自第三军医大。
2.1.2 菌株及载体
噬粒 pComb3XSS 由美国Barbas 实验室馈赠；Top10 F’、辅助噬菌体VCSM13 为本中心保存；大肠杆菌(Escherichia coli)XL1-Blue 由重庆工学院馈赠。
2.1.3 试剂及耗材
TRIZOL 购自Invitrogen 公司；M-MLV 反转录酶购自Promega 公司；限制性内切酶SacⅠ、XbaⅠ、SpeⅠ、XhoⅠ及T4 DNA 连接酶均购自NEB 公司；其它试剂为国产分析纯。
2.1.4 引物
参照美国 Scipps 研究所鼠源抗体库构建的引物及《实用分子生物学操作指南》[7]设计简并引物，由上海生工合成。
2.2 方法
2.2.1 动物免疫
将柑桔溃疡菌用生理盐水稀释至 1×108CFU/ml，取0.5 ml 腹腔注射6～8 周龄BALB/c小鼠，每周免疫一次，免疫4 周后用ELISA 法测血清效价，加强免疫3 天后取脾，并用无菌注射器针柄在200 目的不锈钢滤网中将脾脏分离成单个细胞，加入Eppendorf 中，离心去上清，用液氮速冻后70℃保存。
2.2.2 提取RNA 及cDNA 第一链扩增
按照 Trizol 试剂盒说明书提取小鼠脾脏RNA，通过凝胶电泳及测OD 值确定RNA 的质量。以Oligo-dT 为引物反转录合成cDNA 第一链。
2.2.3 PCR 扩增轻链及重链Fd 段基因
通过温度梯度摸索 PCR 反应条件为94℃ 50s，57℃ 50s，72℃ 10min，35 个循环，PCR产物在1.5 %琼脂糖凝胶电泳验证, 采用凝胶DNA 回收试剂盒回收PCR 产物。
2.2.4 鼠源抗柑橘溃疡病菌Fab 抗体库的构建
将 κ 链基因 PCR 产物与 pComb3xss 分别用 SacⅠ/XbaⅠ消化，经琼脂糖电泳分离并纯化回收, 取1.0 μg 载体片段与0.2 μg κ 链片段在80 μL T4 DNA 连接酶反应体系中进行连接反应, 经沉淀回收后电击转化XL1- Blue 感受态细菌, 加入2 mL SOC，37℃、250rpm 培养1 h 后取少量铺盘测定, 其余加入100 mL 含50 μg /mL 氨苄青霉素和10 μg/mL 四环素的 SB 培养液中培养过夜。提取质粒, 得到轻链库。再分别将轻链库与Fd 段用 SpeⅠ/XhoⅠ酶切后回收，按前法进行连接、转化、细菌扩增及转化子测定。在加入100mL SB 培养液1 h 后加入1 mL 约1012 pfu 的辅助噬菌体 VCSM 13，再培养2 h 后，加卡那霉素至70 μg/mL，37 ℃振荡过夜。次日离心收集上清, 加 PEG8000 至4%、NaCl 至3%,冰浴30min，4℃、9 000 r /min 离心20 min, 弃上清, 用2 mL 1%的BSA- PBS 溶解沉淀, 12000 r /min 离心5 min, 弃去不溶性沉淀, 所得上清即为 Fab 噬菌体抗体库。
2.2.5 阳性克隆的菌落PCR 鉴定及酶切鉴定
分别挑取 10 个轻链库及 Fab 库阳性克隆，经 PCR 初步鉴定后再分别用 SacⅠ/XbaⅠ及 SpeⅠ/XhoⅠ 双酶切鉴定其重组率。
3. 结果与分析
3.1 总RNA 的提取
对提取的总RNA 进行琼脂糖凝胶电泳检测，其中总RNA 电泳条带以28S rRNA 和18SrRNA 为主，用分光光度计测得总RNA 的OD260 / OD280 的比值为1. 8，浓度约为1μg/μL，显示总RNA 质量好，无降解，符合试验的要求。
3.2 轻链和重链Fd 段基因的扩增
以 cDNA 第一链为模板，分别以轻链和重链Fd 段基因的3′端引物和5′端引物进行PCR 反应，分别扩增出轻链和Fd 段。将PCR 产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳，显示在约680 bp 处可见明显的扩增条带(如图2)，与理论值相符。M 为DNA 分子量标准MarkerⅡ, 1-7 分别为轻链基因的PCR 产物，8-10 分别为重链基因的PCR 产物。
3.3 轻链基因库的构建
1μL 轻链重组噬粒的转化细菌菌液铺板克隆数为 1009 个，测定转化效率为1×106，通过菌落PCR 法鉴定轻链重组质粒，电泳结果显示 10 个克隆在680 bp 处都有条带，均判定为阳性克隆，用SacI 和XbaI 对重组噬粒进行酶切反应再次验证，酶切后产物电泳发现10 个克隆均有约4 kb + 680 bp 两个条带，判定为阳性克隆(如图3)，由此计算重组率约为100%。
3.4 噬菌体Fab 抗体库的构建
1μL 含抗体Fab 片段基因的重组噬粒转化细菌菌液铺板有2006 个克隆子，计算出转化率约为2×106。随机挑取10 个转化后的克隆子，通过菌落PCR 法鉴定，其中有8 个菌落扩增出680 bp 的片段，判定为阳性克隆，用XhoI 和SpeI 对重组噬粒进行酶切反应再次验证，酶切后产物电泳发现8 个阳性克隆均切出4 kb + 680 bp 两个条带，判定为阳性克隆（如图 4），由此计算重组率约为80%，库容量为1.6 ×106。经过辅助噬菌体VCSM13 的超感染，在PEG 沉淀浓缩后，得到的上清即是噬菌体抗体库，测得噬菌体抗体库滴度为2.4×1011 cfu。
4 讨论
随着基因工程的不断发展，一些小分子抗体在疾病的诊断治疗方面越来越受到重视。但是在植物病害方面的应用却比较少，目前本实验室已经得到了抗柑桔溃疡病菌亲和力较高的ScFv抗体[8]，但由于其稳定性不够，影响了实际应用，相比之下Fab抗体弥补了这一不足[9]。
在本研究中采用柑桔溃疡病菌免疫的小鼠为建库源，从理论上来说，已包含抗柑桔溃疡病菌的各种抗体基因，而且在构建噬菌体抗体库时，抗体重链基因和轻链基因之间的随机组合进一步丰富了抗体对抗原识别的多样性。 有研究表明，107个特异性抗体分子就能识别全部抗原决定簇的99%， 构建一个库容为108 的组合噬菌体抗体库，一般可以认为基本上包括了所有的抗体分子。目前所构建的各类抗体库，库容一般介于106-108[10]，我们构建的抗体库，库容为1.6×106，滴度为2.4×1011 cfu，基本达到建库要求，能满足多样性的要求[11]。在以pComb3XSS为载体的噬菌体展示系统中，克隆位点下游含有有一个能够编码6个组氨酸的His-tag 序列，该序列可作为蛋白标签来进行目的蛋白的检测和纯化，还含有一个琥珀终止子，在非琥珀抑制型的大肠杆菌中只表达目的蛋白，为后期的纯化工作带来方便。
构建过程中的诸多环节都可影响抗体库的质量，载体的转化效率是制约抗体库容量和丰富性的重要因素之一。一般研究中都采用电穿孔法将重组DNA转入宿主菌， 其转化效率最高可达109-1010转化子/μg DNA，但是如果在培养液中使用抗生素，电穿孔的转化效率会显着降低3-5个数量级。本研究中我们制备了超级感受态进行化学转化，运用该方法一般情况下可以获得2×108或者更高的转化效率，比常规的CaCl2转化法要高出2-3个数量级。在我们的实际应用两次转化中获得了106-107的较好转化效率，且转化的结果比较稳定。抗体基因的扩增是影响库容量的另一个重要因素，其中轻链比较容易扩增，在56-58℃均可扩增出比较亮的目的条带，但是重链Fd段的扩增相对困难一些，而且产率也没有轻链基因的高，这可能与重链基因相对复杂有着重要关系。在克隆过程中，为尽量减少对重链基因的操作，增加抗体库的多样性，采用先连接轻链基因，后连接重链Fd段。
5 结论
本研究成功构建了滴度为2.4×1011 cfu 的鼠源抗柑桔溃疡病菌噬菌体Fab 抗体库，为进一步研究柑桔溃疡病的防治工作奠定了坚实的基础。
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