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抗生素微生物检定及比浊法在效价测定中关键控制点
自1929年英国细菌学家弗来明发现了第1个抗生素一青霉素至今已有半个多世纪，随着抗生素种类不断增加，在治疗感染性疾病和保障健康方面作出了令人瞩目的贡献。在当今世界医学临床上，抗生素类药物已是一类不可缺少的重要化学药物，在很多国家的医药T业中产值均居于首位。抗生素在农牧业上也被广泛应用，随着抗生素应用范围的扩大，对抗生素药品的分析工作更加繁重，现代化学分析技术不断发展，特别是各种仪器分析和自动分析技术的日新月异，有可能对各种抗生素进行有效的快速测定，但传统的生物检测法及经典的化学分析方法还是目前各国药典中采用最多、最主要的检测方法。为保证抗生素药品的安全有效性，对抗生素药品的检测及质量控制显得尤为重要。
抗生素微生物检定法是国际上通用的经典测定法，由于微生物检定法的特点是直观和特异地反应抗生素药品抗菌活性的差异，化学测定结果难于准确表征组分组成、含量和活性的关系，许多抗生素品种由于各种原因， 目前没有适当的化学分析方法表征其活性，同时，微生物检定法所需的仪器设备简单，成本低廉，故抗生素微生物检定法目前在各国药典中仍占有重要地位。
1 分类
单组分抗生素由于结构明确，含量和生物活性相一致，采用化学分析方法测定含量是其发展趋势，但对于庆大霉素、乙酰螺旋霉素和吉他霉素等多组分抗生素来说，各国药典均采用微生物效价测定法。
由于抗生素对微生物具有杀菌和抑菌作用，这是其他物理学或化学方法不能达到的，因此，用抗生素对细菌的抑制程度来检定和表示效价是有实际意义的。抗生素微生物检定法可分为稀释法、比浊法和管碟法。
2 微生物比浊法测定原理及优点
将不同质量浓度的标准品、供试品和接有试验菌的液体培养基加入比色池中，经培养一定时间，约3～4 h，通过抗生素对细菌的抑制作用来观察试验菌生长混浊度，其混浊程度与细菌数的增加存在直接关系，当一定光束照射在混浊的液体培养基时，测定其透光率。
采用抗生素比浊法测定抗生素，保证了浊度测定中的培养温度、培养时间和测量结果的均一性，实现了在线检测，并通过试验材料的标准化和统一化，控制培养基和缓冲液的质量，可保证相对稳定的水平，降低抗生素微生物检定的测定误差，耗时短，出结果快速，降低可信限率，借助仪器检测可同时测量3批样品，减少人为因素。
3 抗生素微生物检定比浊法在效价测定中关键控制点
3．1培养温度的控制比浊法对温度的要求较管碟法更加精确，管碟法的培养温度要求(37±0．5)℃ ，而比浊法为(37±0．1)℃，对温度的要求更加严格，在比浊法培养过程中，温度的均一性控制非常重要，保证各点温度的均匀是保证细菌正常生长的关键因素，也是试验成功的重要因素。
3．2仪器结构与比色池的排列采用的仪器型号为WBS一100微生物比浊法测定仪(北京先驱威锋技术开发公司)，其排降为拉丁方排列，可抵消培养过程中区域性的误差，使分组更加明确，排除培养基加入时间先后的误差。仪器中的感温器必须正确放置，使温度得到更好的控制。试验中采用振摇培养，不致使细菌沉降于比色池底部，增加氧气循环，有利于细菌生长。
3. 3菌液的影响因素配制：取金黄色葡萄球菌CMCC(B)(26003)的第三代营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，35～37 cI=培养2O～22 h后，用0．9％ 无菌氯化钠注射液洗下菌苔备用。菌液应当天配制，当天使用。如采用冰箱放置第2天使用的菌液，此时菌液中的细菌开始老化，并部分死亡，所测出的数据不稳定，造成较大的误差。
3．4培养基成分及pH的影响细菌的生长速度，在没有外加抑制物存在的情况下与培养基的成分、pH、培养温度、通气条件及细菌内在的繁殖能力有关。培养基的营养成分应能满足细菌快速生长的需要，培养基的pH也是影响细菌生长的关键。一般情况下，pH偏低会导致金黄色葡萄球菌生长缓慢，使培养物浊度减少，误差增大，pH过高也会导致结果偏离，所以，适宜培养基的pH灭菌后应在7～7．2。
3．5比色池清洁度的影响测定用的比色池应采用硫酸一硝酸(95：5)浸泡，并用蒸馏水冲洗干净。抗生素比浊法测量质量浓度一般为0．1～1 U／mL，而原始溶液质量浓度为1 000 U／mL。在稀释过程中，所有试验物品一定要清洗干净，消毒灭菌，试验中一旦污染会导致被污染管浊度异常或造成同质量浓度抗生素管结果差异明显，可信限升高(可信限率(FL)％)，可采用清水冲洗高质量浓度器具，采用专用洗刷池为宜，并与培养后的比色池或试管分开清洗，清洗时不得用毛刷，防止划痕。
3．6气泡的影响因素待加人各种所需物质后，将比色池物质充分混匀，采用WBS一100微生物比浊法测定仪，可自动间歇振摇，振摇时不得产生气泡，有气泡则干扰测定结果，此点尤为重要。
3．7微生物的污染(菌种不纯)在配制菌悬液时所用器皿必须严格高压灭菌，切忌使用未经灭菌的试管及物品进行试验，防止造成原始菌液的污染。另外，菌液的不纯也属于微生物污染，表明正常试验菌种被其他杂菌所污染，从而导致生物反应紊乱，导致细菌对抗生素的反应灵敏度降低，曲线不规则等现象。使精密度差，因此，在操作中要保持试验环境清洁，严防污染微生物，一旦被污染，可重新开启一支冻干菌种，从新传代，致使试验菌达到要求。
3．8时间的一致性在加入标准品和供试品溶液及含试验菌的培养基后，混合均匀，为防止培养基中的试验菌提前生长，必要时将培养基放置2～4℃冷却，适时取出加入菌液，此法可避免试验时加注时间过长和加入先后不同而造成误差，每个比色池的培养时间应一致。
3．9抗生素微生物比浊法展望随着抗生素微生物比浊法的出现，2012年兽药典将收载约10个抗生素品种采用比浊法测定效价，这将大大减少耗时和提高检测效率。随着检测技术的不断提高，抗生素微生物检定比浊法在菌液质量浓度和加菌量、抗生素质量浓度的稀释范围、培养基、缓冲液标准控制、培养时间、温度、样品和标准品质量浓度的制备、上机质量浓度范围、全程试验的环境条件及所用物品的灭菌要求，污物的处理等应制定出严格的规范和要求，是抗生素微生物检定比浊法的发展方向。
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