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生物酶解破壁提制葛根黄酮的工艺
引言
葛根富含葛根淀粉和总黄酮（含量约为1-12%）。由于我国农作物利用较粗放，葛产业基本上集中在葛根淀粉的提取[1]，淀粉中异黄酮含量仅占葛根总黄酮的2.4％，95％以上尚留在葛根废渣被丢弃，高附加值的天然活性成分浪费严重。作为医药和保健食品的原料或添加剂[2]，目前，国际市场葛根黄酮每年需求量约在500－800 吨，在美国，食用酮类食品的人数超过１亿３千多万人；而我国的每年需求量约在150 吨左右。将生物酶促法应用到葛根黄酮的提取，主要是利用微生物充分破坏植物细胞组织结构，将植物组织分解成小分子物质，减少提取传质阻力，充分释放活性成分，具有提取物稳定、纯度高、能耗低、有机溶剂使用量少等特点[3]；目前，汤海鸥[4]、施英英[5]等采用纤维素酶和木聚糖酶等对提取葛根黄酮进行报道。随着人们对葛根功能性和营养性研究的深入，采用生物酶化工艺，在减少葛产业集约化发展引起的葛根废渣环境污染的同时，实现葛根废渣的资源化利用提供一条新途径。
1 主要仪器、试剂和测试方法
1.1 仪器与试剂
仪器：UV-2450 紫外可见光光度计，DELTA 320-5pH 计，RE-2000 旋转蒸发器，126P/166P高效液相色谱仪，SPX-250-Z 振荡培养箱原料：葛废渣取至重庆北碚农村（除去葛根淀粉）试剂：葛根素（标品）；乙醇（分析纯）、正丁醇（分析纯）、硫酸(分析纯)、氢氧化钠(分析纯)、葡萄糖(分析纯)、甲醇(分析纯)
1.2 实验
1.2.1 菌种培育
选用黑曲霉，分别经过斜面培养、种子液体培养后，将培养好的菌种接种装入液量为60 ml250ml 三角瓶中，接入量为5%，29℃，180rpm，混合培养48h。
1.2.2 微生物酶化提取葛根黄酮
取烘干、粉碎后过40 目筛的葛渣样品3.5g，加入豆粕1.0g 至250ml 干净的锥形瓶中，加入蒸馏水，接入一定量种子液, 设定pH 值和发酵时间，考察接种量和培养基质及不同工艺参数对葛根黄酮溶出的影响
1.2.3 主要控制参数及发酵工艺流程
葛根渣与辅料之比为7:2，固液比为1:20，接种量50%，发酵温度为30℃，发酵时间为60h，pH 值为5，豆粕的重量百分量为5%～25%；接种量为40%；pH 值为6，在30℃下连续反应48h 反应在生化培养箱中进行，间歇通过无菌空气(平均 10min/h)
1.3 葛根黄酮的测定
采用色谱分析方法[6]测定葛根素标品。精密称取葛根素标准品5.2mg，经甲醇定容并配置成1.04mg/ml 的标准溶液后，分别移取1ml、0.5ml、250ul、100ul、50ul、25ul、5ul 标准溶液，再用甲醇稀释并定容至5ml；设定色谱条件为色谱柱C18，柱温30℃，流动相为：甲醇-水（25：75），检测波长为250nm，流速为1.0ml/min，进样体积为10ul；通过分析检测得出峰面积绘制葛根黄酮的标准曲线。得回归方程为：y=35415x-14502， R?=0.9993。
2 结果与讨论
2.1 不同方法的对比实验
2.1.1 葛渣不同处理方式对葛根黄酮含量影响
葛根黄酮等植物有效成分大都被包裹在葛渣细胞壁中。微生物能产生木聚糖酶和内切-β-葡聚糖酶(CMC 酶)，破坏葛渣细胞壁的纤维结构，甚至将其分解成小分子物质，减少提取传质阻力，有效释放葛根黄酮等活性成分。通过图2 葛渣不同处理方式的对比可知，采用黑曲霉和康宁木霉发酵36h 后所得葛根黄酮的含量均高于未发酵处理，其中黑曲霉在发酵60h 时葛根黄酮含量达到最高，为1.078ug/ml。
2.1.2 不同发酵方式对葛根黄酮含量影响
不同菌种对生长环境要求不一样。从图3 可知，采用黑曲霉进行好氧发酵在每一时段其葛根黄酮浓度均大于厌氧发酵产量，且在60h 时能得到葛根黄酮的最大浓度为1.078ug/ml。
原因在于：黑曲霉生长会产生酶，加快葛渣纤维组织降解能力；在这过程中，充足的氧气会促使微生物生长，增加酶产生量，从而促进葛渣纤维组织的降解，提高葛根黄酮的溶出量。
此外，通入氧气还可减少因厌氧发酵造成的恶臭。
2.2 培养基质对葛根黄酮含量的影响
2.2.1 辅料碳氮源对葛根黄酮含量影响
菌种生长有一周期，需要营养底物；如果营养不足，会导致菌种生长所需的能量、碳氮源等成分不足影响生长，减缓纤维素等植物组织分解减缓，阻碍葛根黄酮溶出；但如果营养过剩，又会使菌种提早达到衰亡期，使葛根黄酮溶出受抑制。从图4 可知，辅料豆粕加入量与葛根黄酮的含量关系呈曲线走势，3.5g 葛渣，加入豆粕量为1.0g 时，葛根黄酮的含量最大为0.986 ug/ml。
2.2.2 不同接种量及对葛根黄酮含量的影响
设定黑曲霉接种量为原料的20%、30%、40%、50%、60%的比例加入原料中。由图5可知，接种量为50%即菌液量为1.75ml 时，葛根黄酮的含量最高，为0.529 ug/ml。原因在于菌种含量对葛根黄酮溶出的影响主要表现在如加入的菌种太多，当营养不足时，会加剧菌种之间的竞争，导致太多菌种提前死亡；加入的菌种太少会因营养过剩，还未与植物组织完全发生酶促反应前，便提前达到生长旺盛期顶点，随之衰亡，凋零。
2.2.3 不同发酵温度及对葛根黄酮含量的影响
酶类属于蛋白质类物质，其对温度大都非常敏感。适宜的温度不仅可以加快微生物的生长和繁殖，还可以增大酶活性，促进植物纤维的降解。由图6 可以看出，发酵温度对葛根黄酮影响很大，在温度为30°C 时，葛根黄酮含量最高为1.4719 ug/ml。
2.2.4 不同pH 值及对葛根黄酮含量的影响
体系环境的酸碱性也会影响菌种的生长。由图7 可以看出，当体系的pH 值为5 时，黑曲霉生长最适应，葛根黄酮其浓度能达到最大值，为346.63 ug/ml。
2.3 超声波萃取葛根黄酮产品
2.3.1 最佳单因素条件的复合实验
通过单因素探讨，确立出生物酶化法提取葛根黄酮的最佳实验条件；取葛渣3.5ｇ，选定各最优单因素条件，进行最优单因素的复合实验，经高效液相色谱法分析，谱图如图8（a）；测得葛根黄酮浓度为37.688ug/ml，葛根黄酮含量明显高于任一单因素所得值；对照标品的液相色谱图图8（b），其峰型与出峰世界时间相似；此外，样品谱图在9 分钟前还存在其他峰，说明采用生物酶促反应，还可以得到葛渣其他活性成分。
2.3.2 超声波协助生物酶化反应提高产品含量
为充分提高葛根黄酮产率，在获得生物酶化反应的最佳工艺条件基础上，分别选用3.5克葛渣，通过提取产品量，考察超声波协同作用。其结果见表1。从图9 可知，生物酶化反应获得葛根黄酮为1.446mg/g,而超声波协同生物酶化反应获得葛根黄酮为2.974 mg/g，含量明显高于其他两种反应，葛根黄酮含量结果表明超声空化作用有助于破坏细胞膜，促进黄酮类化合物释放与溶出,且超声波的不断震荡和热效应,不仅有助于溶质扩散,同时对原料起水浴作用。
3 结论
（1）从生物多样性出发，采用生物酶促反应有助于葛渣中葛根黄酮溶出，并经超声波协同处理葛根废渣后，葛根黄酮含量较单一处理的产物高。
（2）从微生物发酵过程中影响因素出发，选用黑曲霉菌种，最优发酵工艺条件为：菌种接种量为50%，固液比为1：20，葛根渣与辅料之比为7：2，发酵温度30℃，发酵时间60h，pH 值为5，能得到葛根黄酮浓度为37.688ug/ml，葛根黄酮含量为每克葛渣含葛根黄酮1.446mg/g；超声波处理能得到2.974 mg/g。
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