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逍遥散对慢性温和不可预知应激模型大鼠的影响
类神经递质含量的影响。方法：应用慢性温和不可预知应激程序对大鼠进行为期11 周的造模，造模后3 周，分别采用逍遥散（19.5g·kg-1、25.0g·kg-1）和丙咪嗪（10mg·kg-1）对模型大鼠进行为期8 周的治疗。实验进程中，定期测定大鼠体重、糖水消耗量；应用开场实验测定大鼠爬行格子数和站立次数；造模、治疗结束后处死大鼠，解剖分离大鼠皮层和海马部位，采用荧光分光光度法测定5-HIAA、5-HT、DA 和NE 含量。结果：与正常对照组比较，大鼠造模后3 周糖水消耗量、爬行格子数和站立次数均明显减少（p<0.01）；与模型对照组比较，逍遥散19.5、25.0g·kg-1 连续给药2 周能显著增加糖水消耗量，但给药4 周、7 周对糖水消耗量影响不明显；与模型对照组比较，逍遥散25.0g·kg-1 连续给药7 周，对大鼠体重、爬行格子数和站立次数表现出提高趋势（p>0.05）;逍遥散25.0g·kg-1 连续给药8 周,能明显提高模型大鼠皮层部位5-HT 含量及海马部位5-HIAA 含量（p<0.05，p<0.01）。结论：逍遥散对CUMS 抑郁模型大鼠表现出抗抑郁作用，作用机制与影响脑内单胺类神经递质5-HT 活性有关。
关键词：逍遥散；慢性温和不可预知应激（CUMS）；抗抑郁
逍遥散出自宋朝《太平惠民和剂局方》，是中医调和肝脾的代表方剂之一，具有疏肝解郁、养血健脾之功效，用于治疗肝郁血虚脾弱证。作为调节情志的经典名方，现代临床中逍遥散被广泛用于精神科疾病的治疗，其中在抑郁症的治疗中应用较多，能使患者情志舒畅、心情愉快、精神状态得以改善，疗效明确，但治疗机制至今尚未完全阐明。实验研究发现[1-3]，逍遥散（10.0g·kg-1 和20.0g·kg-1）连续给药6 天，每日2 次，能明显升高正常大鼠下丘脑去甲肾上腺素(NE)和纹状体多巴胺(DA)含量；连续4 周采用“颈部带枷单笼喂养法”造成大鼠肝郁证模型，逍遥散水煎剂连续治疗2 周后，能降低模型大鼠大脑、间脑和脑干部位中5-羟色胺(5-HT)与DA 含量，升高NE 含量；对“慢性束缚应激法”所致肝郁证模型大鼠，造模1周后用逍遥散（19.2g·kg-1）治疗4 周，能显著提高模型大鼠脑组织中NE 和DA 水平。研究结果提示逍遥散对中枢神经系统5-HT、NE 及DA 能神经递质的影响作用，可能是其发挥“疏肝解郁”功效的药理学基础之一。
由于抑郁症的形成是致病因素长期作用的结果，因此在抑郁动物模型的制备时，必须考虑长期、多致病因素的叠加作用。慢性温和不可预知应激模型(Chronic Unpredictable MildStress, CUMS)的制备，是采用随机组合的多种不同应激因子（如冰水游泳、噪音刺激、异物刺激等）对动物长期刺激而进行造模。该模型能较好地模拟人类抑郁的核心症状——快感缺失[4,5]（以糖水消耗量反映），同时模拟了抑郁患者运动能力、社交能力、探索行为能力下降等症状表现，也能造成脑内单胺类神经递质(5-HT、NE 和DA)含量的改变[6,7]，其理论依据与人类抑郁症中慢性、低水平的应激源促进疾病发生、加速疾病发展的机制更接近，是目前较为推崇、使用广泛的抑郁动物模型[7-13]。本研究采用CUMS 程序复制大鼠抑郁模型，观察逍遥散对该模型大鼠体重、活动量、糖水消耗量及脑内单胺类神经递质水平的影响，以期为逍遥散“疏肝解郁”之功效及临床治疗抑郁症的应用提供药理学依据。
1. 材料与方法
1.1 动物
SD 大鼠，♂，清洁级，初始体重190-220g，四川省医学科学院实验动物研究所提供。合格证号：scxk（川）2004-16。
1.2 药物
逍遥散(Xiaoyao San, XYS)：柴胡9g，当归9g，白芍9g，白术9g，茯苓9g，薄荷4.5g，生姜4.5g，甘草4.5g。药材购于成都中医药大学附属医院。以浸膏量为评判指标，采用3×3因素正交表，综合考察加水量、煎煮时间和煎煮次数三者的影响作用，经DPSv3.01 软件统计分析后，确定逍遥散水煎剂的制备工艺如下：药材加4 倍量水，煮沸后煎煮20min，同法煎煮三次，合并三次滤液，浓缩成1.25g·ml-1 的药液，4℃冰箱保存。此外，取适量浓缩液、柴胡标准药材（四川省药品监督管理所，批号120992－200504）及配方中柴胡药材的甲醛溶液（参照2005 版药典第198 页所记载的方法处理），在同一硅胶G 薄层板上点样，于365nm紫外灯下检查，三者均在薄层板上的相同位置显示相同颜色的柴胡总皂苷荧光斑点，表明复方所用柴胡符合药典规定，且水煎剂中柴胡可被检出。
丙咪嗪 (Imipramine, IMI)：Sigma，批号I0899。生理盐水配制成1mg·ml-1 溶液，临用前配制。
1.3 开场实验
参照Chen CZ [13]方法，将大鼠放入自制开场实验箱的中心位置（100cm×100cm木箱，底部等分为100个10cm×10cm小格），适应2min后，观察随后4min内大鼠的爬格子数（以大鼠的四肢均进入一个格子为一格）和站立次数（以大鼠的两前肢离开地面，身体直立为一次）。开场实验分别在大鼠分组前、造模3周及10周后进行，共3次。
1.4 糖水消耗实验
参照 Stathis 方法[7]，开始造模前一周里对大鼠进行2 次1%蔗糖水偏好训练（每个鼠笼放置已定量的2 个喂水瓶，1 瓶纯水，1 瓶1%蔗糖水，喂水1h 后撤除）。于CUMS 程序开始前进行第一次糖水消耗量(Sucrose Consumption，SC)测试。糖水偏好训练和测试均于大鼠禁食禁水23h 后进行
1.5 慢性温和不可预知应激模型的建立
参照Stathis方法[7]略作改变。刺激因子包括电刺激＋噪音、冰水（4℃）游泳、禁食、鼠笼（45o）倾斜、潮湿垫料、禁水、合笼、禁食禁水、异物放置、异味刺激，具体执行安排见下表。共执行11周。
1.6 实验分组与给药方式
大鼠适应性饲养 1 周，5 只/笼。1 周后根据体重和开场实验结果随机分为正常对照组和模型组，正常对照组的大鼠5 只/笼，模型组的大鼠均单笼饲养。模型组大鼠造模3 周后，按体重和开场实验结果随机分为模型对照组、模型+逍遥散高、低剂量组、模型+丙咪嗪组，动物仍保持单笼饲养，正常对照组动物饲养方式不变。造模第4 周开始，模型对照组每日灌胃蒸馏水，模型+逍遥散高、低剂量组每日灌胃逍遥散水煎剂（剂量分别为25g·kg-1、19.5g·kg-1），给药体积2ml·100g-1。模型+丙咪嗪组每日腹腔注丙咪嗪15mg·kg-1，给药体积1ml·100g-1。各组动物连续给药8 周。
1.7 大鼠皮层与海马部位单胺类神经递质的测定
各组大鼠末次给药 30min 后处死，在冰台上迅速分离大脑皮质和海马部位，称重后于干冰中快速冷冻，置-70℃保存待测。大鼠大脑皮层和海马部位5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）、5-HT、NE 及DA 含量测定采用荧光分光光度法测定（RF-5301 型荧光分光光度仪，日本岛津）。
1.8 统计学处理
数据以 X ±s表示，各组数据呈正态分布时采用SPSS11.5统计软件进行One-Way ANOVA分析，非正态分布采用DPSv3.01统计软件进行K-W检验。
2. 结果
2.1 CUMS 程序实施前及实施后1、3 周对大鼠开场实验和糖水消耗量的影响
见表2。CUMS程序实施前正常对照组与模型组大鼠的体重、爬行格子数和站立次数均无明显差异，但模型组大鼠的糖水消耗量显著减少，提示单笼饲养对动物奖赏反应性的抑制。
CUMS程序实施1周后，与正常对照组比较，模型组大鼠的体重无显著差异，糖水消耗量仍表现出明显的下降。CUMS程序实施3周后，与正常对照组比较，模型组大鼠的爬行格子数、站立次数和糖水消耗量均显著减少，但体重无明显差异，提示CUMS程序的应用已引起动物快感缺乏、运动能力和探索能力下降。
2.2 逍遥散单次给药及连续给药2 周、4 周对CUMS 模型大鼠体重和糖水消耗量的影响
逍遥散给药1 次对模型动物的糖水消耗量无显著影响；连续给药2 周，逍遥散高、低剂量能明显提高模型动物的糖水消耗量，体重影响不明显；连续给药4 周，逍遥散提高模型动物糖水消耗量的作用反而减弱，仅表现出一定提高趋势。
2.3 逍遥散连续给药7 周对CUMS 模型大鼠开场实验和糖水消耗量的影响
在CUMS 程序连续实施的10 周，与正常对照组比较，模型组大鼠开场实验中的爬行格子数与站立次数、及糖水消耗量等指标仍表现出低下，提示该模型的有效性和持续性。与模型对照组比较，逍遥散连续给药7 周对以上指标改善作用不明显。
2.4 逍遥散连续给药 8 周对CUMS 模型大鼠大脑皮层和海马部位单胺类神经递质含量的影响
与正常对照组比较，模型对照组的大鼠皮质部位5-HT、DA 和NE 含量，以及海马部位5-HIAA 含量均明显降低，逍遥散连续给药8 周，能显著提高皮层5-HT 含量和海马部位5-HIAA 含量，并对皮层部位DA 和NE 含量表现出提高趋势。
3. 讨论
3.1CUMS 抑郁模型的评价
采用 CUMS 程序处理大鼠3 周后，与正常对照组的大鼠比较，模型大鼠爬行次数、站立次数及糖水消耗量均明显降低（P<0.01，P<0.05），由于大鼠的爬行格子数能反映其活动性，站立次数能反映其对周围环境的好奇性与探索性，糖水消耗量能反映其对奖赏的反应性，因此结果表明本研究所采用的CUMS 程序，能在大鼠身上模拟抑郁症病人所表现出的冷漠、运动减少及快感缺失等临床特征；进一步连续造模至10 周，与正常对照组比较，模型组大鼠的爬行次数、站立次数及糖水消耗量依然显著低下，且体重均有所减轻，提示能模拟临床抑郁症病人食量减少、体重下降的表现。综上，本研究CUMS 造模程序能持续、有效地引起大鼠快感的缺乏，表明模型的成功。此外，大鼠开场实验的次数，部分文献报道一周一次，本研究仅进行3 次，且间隔时间不同，主要依据于前期实验结果发现：每周一次，动物对实验环境易产生适应性，易出现假阴性结果。
单胺类神经递质假说在抑郁症的发病机制中占有重要地位，本研究发现大鼠经CUMS程序连续处理11 周后，可导致模型大鼠皮质部位5-HT、DA 和NE 水平，以及海马部位5-HIAA 的含量明显低于正常对照组，但海马部位5-HT、DA 和NE 水平变化不明显，这与临床上多数抑郁症患者脑内5-HT 和NE 水平低下相似，可认为该模型的成功。至于皮层与海马部位递质水平变化的不同，笔者推测这与中枢NE 和5-HT 能神经末梢主要投射于大脑新皮质，少量分布于海马有关，因此作为与抑郁症关系最密切的神经递质，NE 和5-HT 含量的变化在皮质部位较为显著。但亦有抑郁症慢性应激程序（非慢性温和不可预知应激，但也是多种不同的刺激反复作用，只是强度偏大）连续实施4 周，模型大鼠海马部位5-HT 含量变化较皮质部位更为显著的报道[6]，故模型动物脑内单胺类神经递质的变化与刺激强度、刺激时间不同等因素有关。
3.2 逍遥散对CUMS 抑郁模型的影响
本研究结果表明，经逍遥散水煎剂25g·kg-1连续治疗7周后，治疗组大鼠的体重、活动量较模型组均有增加，提示逍遥散能对抗CUMS造模程序对动物活动量和体重的抑制作用，与逍遥丸连续预防性给药21天提高CUMS模型大鼠体重与自主活动的文献报道相似（这篇文章只观察了逍遥散对模型大鼠自主活动的作用，没有对体重的影响，现在逍遥散对CUMS模型大鼠体重的影响还没有看见报道）[15]。但是，逍遥散治疗后对模型大鼠糖水消耗量的提高作用并未表现出连续性，在治疗2周时能显著提高模型动物的糖水消耗量，在后面的治疗过程中仅表现出提高趋势或无明显影响作用。查阅资料及结合本研究室其他实验结果（另报道），笔者认为可能与以下影响因素有关：（1）动物种系，有学者就Wistar和SD大鼠对糖水消耗的反应性进行过比较[7]，发现Wistar大鼠更易出现糖水消耗量下降现象，丙咪嗪对Wistar大鼠的治疗效果显著优于SD大鼠。（2）5-HT受体密度或功能的改变，有报道显示[16]，CUMS程序持续8－9周可导致大鼠大脑皮质5-HT2A受体密度上升，而本室前期小鼠实验研究初步提示，逍遥散急性给药可显著拮抗5-HT2A受体，长期给药则使该受体出现敏感性下调的表现，由此推测逍遥散给药2周提高CUMS模型大鼠糖水消耗量的作用与阻断5-HT2A受体有关，然而随给药时间和CUMS程序实施时间的延长，模型大鼠皮质部位5-HT水平逐渐下降而5-HT2A受体密度逐渐升高，虽然逍遥散可使5-HT2A受体的敏感性降低，但由于其密度增加，二者作用相互抵消，故逍遥散提高糖水消耗量的作用不明显。（3）实验操作，由于大鼠对喂水瓶有啃咬行为，导致个别糖水消耗测定实验中喂水瓶漏水从而直接影响实验结果，因此确保喂水瓶的密闭性至关重要。
实验结果表明，逍遥散连续8 周治疗后对模型大鼠大脑皮质部位5-HT、DA 和NE 含量的降低有对抗效应，其中以提高皮质部位5-HT 含量的作用尤为显著，但对5-HT 的代谢产物5-HIAA 含量影响不明显，提示逍遥散可能通过促进皮质部位5-HT 合成、抑制5-HT 代谢或再摄取而提高5-HT 水平；逍遥散连续8 周治疗后对模型大鼠大脑海马部位5-HIAA 含量的降低有明显升高作用，但对5-HT 含量影响不明显，提示逍遥散可能促进模型动物海马部位5-HT 的更新。综上，笔者认为逍遥散的抗抑郁作用可能主要与影响不同脑区5-HT 能神经系统活性有关。
本次研究发现，三环类抗抑郁药丙咪嗪对模型动物体重影响不明显，这可能与药物长期给予所致的毒性有关，结果与文献报道亦相吻合[7]。虽然丙咪嗪能通过抑制突触前膜对NE、5-HT 的重摄取从而提高突触间隙递质浓度达到抗抑郁作用，但长期给予会引起神经系统的适应性，应通过增加剂量达到原有效应；此外，递质在突触间隙中浓度的增加也会加速其被单胺氧化酶灭活的过程，因此本次实验发现，长期应用丙咪嗪对模型大鼠脑内单胺类神经递质含量的影响并不明显。
综上，基于模型大鼠行为学、糖水消耗量及脑内单胺类神经递质含量的变化，本次研究所采用的CUMS 造模程序成功地制备了大鼠抑郁模型，证明了该造模方法的有效性，但同时应注意动物种系、刺激因子的强度与安排、实验条件的一致性等众多影响因素对造模效果和指标准确性的影响。逍遥散连续治疗给药2 周对模型大鼠糖水消耗量的异常变化有一定的对抗效应，但此效应未表现出持续性，推测与逍遥散长期给药引起5-HT2A 受体敏感性下调、而造模程序引起该受体密度上升这一矛盾有关；逍遥散连续治疗给药8 周，能显著提高模型大鼠大脑皮层单胺类神经递质含量，特别是5-HT 水平，其次能升高海马部位5-HIAA 含量。
以上实验结果表明逍遥散具有抗抑郁作用，作用机制可能与影响中枢5-HT 能神经系统活性有关，但对于逍遥散是否直接影响5-HT2A 受体密度还是影响其功能，是否通过影响5-HT转运体的功能而影响5-HT 水平的变化，是否对不同脑区5-HT 能神经系统产生不同的作用，均有待进一步深入研究。
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