温度控制在蛋白质结晶中的应用研究
0 前言
X 射线单晶衍射技术是目前最成功的蛋白质结构检测方法。PDB 数据库中已有超过6万个蛋白质结构，而其中85%以上的结构是通过这个方法解析得到的。虽然如此，蛋白质结构解析的速度仍然远低于新功能性蛋白质的研究需求速度。近几年，世界范围内有超过1800 个基因组测序工程，其中1500 个正在进行，335 个已经完成测序工作[1]，已经产生了超过320 万非冗余蛋白质序列[2]。因此，必须加快蛋白质结构的解析速度以适应蛋白质序列测序工作的快速发展。
目前，生长大的衍射质量的蛋白质晶体仍旧是结构检测的最大障碍[3-5]。成功获得适合衍射的蛋白质晶体分为两个步骤[6]：第一步是筛选结晶条件获得晶体。当前，稀疏矩阵法[7]
是应用最广泛的结晶筛选方法，该方法利用大量不同的结晶溶液进行蛋白质结晶来寻找合适的结晶条件。第二步是优化结晶条件获得衍射质量的晶体。
蛋白质结晶过程受多种因素影响，如沉淀剂类型、浓度、pH 值、温度等。由于溶液的化学条件复杂，大多数研究着重在pH 值、盐的类型、浓度和添加剂如聚合体或多羟基化合物等条件上。虽然温度一直以来被认为很重要[8]，但是没有受到足够的重视。传统的蛋白质结晶实验是在恒温条件下进行的，应用最广泛的是277K 和293K[9]。事实上很多蛋白质只有在其适合的温度条件下才能结出晶体[10]。
温度对蛋白质结晶的影响，从本质上说是由于温度的改变引起蛋白质的溶解度的改变，从而改变过饱和度，继而影响蛋白质的形核和晶体生长过程[11]。Christopher 等人[12]任意选择30 种蛋白质，发现其中86%的蛋白质其溶解度受到温度的明显影响。通常温度变化1K，溶解度变化约10% [13]。另外，在高沉淀剂浓度下，温度对蛋白质溶解度的影响显著减小[14]。
控制温度是重复结晶实验的先决条件[15]。
温度的研究主要集中在提高晶体质量[16]，提高结晶筛选成功率[17,18]，溶解性[19-21]，和形核速率测量上[22]。温度诱导方法既可以提高蛋白质结晶筛选的成功率，同时也可以用来获得高质量的蛋白质晶体。利用温度控制蛋白质结晶的方法有很多，我们将对恒温（筛选最佳结晶温度）及变温下的蛋白质结晶研究进行综述。
1 恒温应用于蛋白质结晶
不同蛋白质的最佳结晶温度不同。同一种蛋白质不同溶液体系下，由于溶解度与温度的关系不同[23]，最佳结晶温度也不同。同一种蛋白质，温度影响溶解度的趋势可以通过改变沉淀剂的类型来逆转。如Histamine and V8 protease (P6306)[23]在100mM Na Acetate, 100mMNH4SCN, 20%(w/v)PEG4000， pH 5 的溶液中，其溶解度随温度增加而增大；而在100mMMOPS, 100mM NH4Br, 80%(w/v)PEG400，pH 7 的溶液中，其溶解度随温度增加而减小。大多数情况下，每种蛋白质在特定溶液条件下，均有自己的最佳结晶温度，因此需要考虑结晶温度的优化。
1.1 溶液局部区域控制温度
蛋白质结晶可以通过两种方法实现：一种方法是异相形核，另一种方法是均匀形核。第一种方法需要有诱导形核的表面，而选择合适的表面是这种方法的关键因素。第二种方法中需要形核的过饱和度比晶体生长所需过饱和度高很多，因此，形核的数量和晶核生长的速度都很难控制。温度可以用来控制晶核的形成数量和晶体的生长速度[24]。DeMattei 等人[25]发展了一种控制形核和生长的方法，该方法选择接近过饱和的均匀溶液条件，在部分区域改变温度使其到达过饱和，从而控制形核的位置和数量。通过这种方法控制溶液小区域的温度实现更少晶核的形成，成功生长了高质量的溶菌酶晶体。
1.2 寻找最佳温度用于蛋白质结晶
每种蛋白质的最佳结晶温度是不同的。在生长蛋白质晶体过程中，需要寻找最佳结晶温度。由于重组云杉卷叶蛾抗冻蛋白[26]的微观不均一性导致这个蛋白很难结晶，Leinala 等[26]
通过在不同温度下筛选结晶条件，结果在318K 下获得了衍射质量的晶体。研究发现，在最佳结晶温度下生长蛋白质晶体减少了蛋白质分子本身动态构象的微观不均一性。GrpE 蛋白是DnaK 蛋白的辅酶，是一种促进蛋白质分子正确折叠的分子伴侣[10]。它是从一种最佳生长温度为338-345K 的嗜热菌中分离得到的，这种蛋白质必须在313K 进行热处理才能生长出晶体，如果不进行热处理就没有晶体出现。这是一个典型的温度诱导方法在蛋白质结晶中应用的例子。
Bartling 等人[27]研究了温度对去铁铁蛋白结晶的影响。研究发现，在三种镉浓度下，随着温度的增加最终导致了的晶体尺寸线性增加。在312.5K 下生长的去铁铁蛋白晶体最大。
在低的镉浓度下，温度的影响更显著。随着镉浓度的增加，去铁铁蛋白的溶解性对温度变得不敏感，这和溶菌酶一样。在高沉淀剂浓度下，蛋白质溶解度不依赖温度，而在较低沉淀剂浓度下，溶解度强烈依赖温度[21]。
即使晶体形成后，温度也会引起蛋白质构象的改变[28]。为了抵挡X 射线衍射源的辐射，晶体一般需要保持在低温状态下，低温可以增加晶体的分辨率，但也有可能引起蛋白质构象的改变。Dunlop 等人[28]对此进行了系统的研究：将同一种蛋白质晶体在三个室温和三个低温数据进行了比较。结果显示，虽然低温下可获得高分辨率的结构和更精确更细节的信息，但是它们系统地背离了室温结构，甚至在结构核心部分观察到显著的区别。这种变化在蛋白质表面更常见。这些区别会影响生物学的解释，因为很多重要的生物过程发生在蛋白质表面。
因此，虽然在蛋白质结晶中可以获得高质量的低温数据，但是，室温数据仍是需要的，特别是当研究的蛋白质特性对温度的改变很敏感时。
1.3 最佳温度筛选装置用于蛋白质结晶
温度的细微改变可以显著影响蛋白质的溶解度。例如，温度变化0.5K 时，溶菌酶的溶解性就会变化很大，由于这个原因，一些蛋白质的结晶温度需要精确控制。Landsberg 等人发明了一种最佳温度筛选系统（Thermo-screen）[29]，该系统在一块192 孔坐滴板上设置温度梯度，温度范围277-372K，最大温度梯度20K，间隔精度0.3K。系统可以同时检测12个恒温点下，16 个不同的结晶条件。
应用该系统进行了蛋白质结晶实验。实验结果显示温度显著影响溶菌酶晶体的数量和尺寸。在低温（~279K），每孔有数百个小晶体。从恒温279K 增加到恒温292K，292K 下产生的晶体更少，晶体尺寸更大，质量更好。这和增加温度而致溶菌酶溶解度增加的结果一致。
在优化温度293K 和294.5K 之间，观察到每个孔有一些大的六角形晶体。再增加温度到303K导致晶体尺寸的减小，这可能是由于溶解度增加过大或蛋白质已经变性。
人类肾上腺素合成酶苯乙醇胺N -甲基蛋白(PNMT)的结晶实验结果相反。在较低温度（~279K）下，观察到较少的晶体。随着温度的增加晶体数量减少，这和温度与溶解度的关系相一致。在282.5-285.2K 之间，晶体数量更少，晶体尺寸更大（大至0.15mm）。然而，随着温度的再次增加，晶体尺寸减小，数量增加，直至293K，只能观察到大量的小晶体。
这些结果显示，优化温度在283K 左右，PNMT 晶体形貌最好。而这个温度和大家先前用于PNMT 结晶的温度（293K）不同。运用该系统得到过氧化氢酶的优化温度为~293 K。
1.4 筛选最佳温度方法用于蛋白质结晶筛选
Lin 等人[18,30]研究了不同温度下蛋白质的相图，比较了它们的形核区，发现温度改变了形核区的大小，增加了蛋白质的可结晶性。例如，当温度从295K 变为277K 时，RibonucleaseS 和 Trypsin 的形核区面积分别增加2.4 和1.6 倍，同时结晶成功率分别从20.8%增加到42.9%，从12.5%增加到25%。Chymotrypsinogen A 和 Concanavalin A 的形核区增加到1.6和1.7 倍（温度从277K 变为295K），结晶成功率分别从37.5%增加到54.2%，从43.3%增加到73.4%。因此，筛选最佳温度进行结晶，可以显著提高蛋白质的结晶成功率。一种新的Epididymal-specific Lipocalin 蛋白质，通过筛选最佳温度，很快获得了第一个晶体，且晶体分辨率达1.97?。因此，用不同的温度，可以筛选到一些新的结晶条件。
2 变温应用于蛋白质结晶的研究
变温方法主要用于生长高质量的蛋白质晶体，同时也应用于提高蛋白质结晶筛选的成功率。在提高蛋白质晶体质量方面，通过改变温度控制溶解度的改变，从而优化晶体生长速度，生长高质量的蛋白质晶体。在蛋白质结晶筛选时，通常事先无法确定最佳结晶温度，通过温度扫描方法可以覆盖更多可能结晶的温度点，从而获得更多的蛋白质结晶条件。
2.1 变温提高蛋白质晶体质量
2.1.1 温度扫描生长高质量蛋白质晶体
温度对蛋白质的溶解度有显著的影响。有些蛋白质的溶解度随温度增加而增大，如溶菌酶；而有些蛋白质的溶解度随温度增加而减小，如糜蛋白酶原A[31]。溶解度作为温度的函数可用Van't Hoff 公式进行表示[32]：
式中：ΔHxtal 是形成蛋白质晶体时的变，kJ/mol；B 是熵变的参数；R 是摩尔气体常数；C*是蛋白的溶解度，mg/ml；T 是相平衡时的绝对温度。由上式可知，当ΔHxtal 为正值时，蛋白质的溶解度随温度增加而增大；当ΔHxtal 为负值时，蛋白质的溶解度随温度增加而减小。一般认为，结晶时较大的值对应着晶体较大的表面能[33]。我们从一些文章中总结比较了ΔHxtal 的值，发现溶菌酶的ΔHxtal 是负值，这意味着溶菌酶结晶过程是放热过程，因此溶菌酶的溶解度随温度增加而增大。而糜蛋白酶原A 的ΔHxtal 是正值，意味着糜蛋白酶原A 结晶过程是一个吸热过程，因此糜蛋白酶原A 的溶解度随温度增加而减小。
Lu 等人[31]比较了溶菌酶在恒温（277K，305K）和逐渐增加温度程序（277K-305K，3K/天）对蛋白质结晶的影响，糜蛋白酶原A 在恒温（277K，305K）和逐渐减少温度程序（305K-277K，3K/天）对蛋白质结晶的影响。研究发现温度扫描（扫温）对溶菌酶的晶型影响很大，而对糜蛋白酶原A 的晶型影响很小。溶菌酶晶体在恒温305K 时，形貌为拉长状；在恒温277K 时，形貌变的更短、更厚。在扫温实验中，两种形貌都有。另外，恒温277K时与其他程序相比，晶体形貌缺陷更多（裂纹，应力碎片和深的裂口）。这是由于低温时，高的过饱和度驱动晶体生长速度过高而导致晶体缺陷和杂质的合并。温度扫描保持一个稳定的晶体生长速度，生长出了更高质量的晶体[31]。
Budayova 等人设计了一个变温装置[34]，利用相图的知识，加入籽晶后，控制温度保持晶体在结晶溶液的亚稳区，以较低的晶体生长速度缓慢生长高质量蛋白质晶体。了解相图中蛋白质溶解度和温度的关系有利于控制温度生长高质量蛋白质晶体。所示为温度随蛋白质浓度变化的相图示意图。在亚稳区形核不再产生，籽晶以较缓慢的速度生长。该方法利用亚稳区的特点缓慢改变温度，保持晶体在亚稳区缓慢生长。此变温装置生长了高质量的human γ-crystallin E, PA-IIL lectin, yeast inorganic pyropHospHatase, urate oxidase 和 humancarbonic anhydrase II 晶体。
2.1.2 优化冷却速度方法生长高质量晶体
溶液过饱和度的控制对生长高质量蛋白质晶体很重要。实验中可以通过温度来控制溶液的过饱和度，冷却方法是生长大的高质量晶体的重要策略。然而，很少有人研究冷却速度对结晶过程的影响，主要是因为没有便利的工具优化蛋白质结晶的冷却速度。为了寻找理想的条件，研究者必须准备一些不同的温度控制工具，利用不同的冷却速度进行结晶实验的对比。
Adachi 等人[35]发明了一种新的温度控制工具——即时控制温度（TAON）法，它可以在一个结晶板上通过产生温度梯度来设定多个温度点。后来他们对此装置又进行了改进，在TAON上增加电脑控制多个冷却速度[36]。改进的TAON 能够同时在一块结晶板上控制多个冷却速度来生长蛋白质晶体，从而更有效优化了蛋白质晶体生长。
该实验首先将溶菌酶结晶溶液在恒温293K 让其自然形核，没有晶体出现。然后改变结晶溶液温度，冷却速度为1.5–4.0K/天，自动设定最终结晶温度为283K。同时用控温箱快速冷却样品从293K 到283K 作为对照。比较HEWL 的结晶结果发现，在较慢的冷却速度下，晶体数量明显减少。这主要是由于较慢的冷却条件下，形核发生在较高温度（较低过饱和度）。
相较而言，在快速冷却条件下，晶体在较低温度（高过饱和度）下形核，晶体数量更多。这些结果显示在较慢的冷却速度下，蛋白质结晶过程变慢，生长了高质量的溶菌酶晶体。
2.1.3 变温保持恒定过饱和度方法生长高质量晶体
如果想优化生长大的适合X 射线衍射的蛋白质晶体，有必要在结晶过程中控制恒定过饱和度水平从而保持晶体的生长速率不变，这种方法叫做恒量过饱和度方法[37]（CSC：
constant supersaturation control）。该方法可通过控制温度而使蛋白质溶液在亚稳区保持恒定的过饱和度来优化晶体的继续生长但不再形成核子。
Schall 等人在CSC 运算中，用文献[38]中测得的ΔHxtal 及生长速度参数（k，n），文献[39-41]
中溶解度数据（C*），计算出温度的变化。CSC 程序中温度变化范围为293K 到277K。该程序可以从一个较低的过饱和度开始，控制晶体生长速度为一个恒值。应用CSC 程序控制，在NaCl 溶液中溶菌酶晶体的生长速度恒为7?/s。在较低的蛋白质过饱和度下，生长速度为1-3 ? /s。Schall 等人用该方法生长了高质量的四角形溶菌酶晶体。
这项技术需要蛋白质的溶解度对温度很敏感，然而并非所有的蛋白质都如此。这时，可以通过改变结晶溶液的成分来增加温度对蛋白质的敏感性。选择电解液类型和浓度是增加蛋白质溶解度对温度敏感的关键因素。一般来说，蛋白质的溶解性在低盐浓度下对温度的变化更敏感。一种简单的测量蛋白质是否对温度敏感的方法是通过直接测量结晶的变（ΔHxtal）[42]。ΔHxtal 值大则意味着溶解度对温度敏感。增加温度敏感性的优势是通过温度的微小改变使过饱和度从相图中的形核区迅速移向亚稳区。在NaCl 溶液中，当NaCl 浓度从1.25M 减少到0.75M 时，溶菌酶的ΔHxtal 增加3.8 kcal/mol（从10.7±0.9 到14.5±1.7 kcal/mol）。在NaNO3 溶液中，当NaNO3 浓度从0.4M 变化到0.2M 时，ΔHxtal 增加了5.7 kcal/mol （从9.7±0.6到15.4±1.4 kcal/mol）。在NaSCN 溶液中，当NaSCN 浓度从0.12M 减小到0.1M 时，ΔHxtal增加了0.9 kcal/mol（17.5±0.8–18.4±1.0 kcal/mol）。这说明可以改变结晶溶液的成分来增加温度对蛋白质的敏感性，从而通过调节温度改变蛋白质溶解度。此外，在NaCl 中加入NaSCN和NaNO3 低离子强度的盐，增加了蛋白质结晶对温度的敏感性。
将NaCl 替换为NaNO3 和NaSCN，这些盐溶液条件在恒温下生长的晶体衍射质量差，当调用CSC 温度程序控制后晶体更大，X 射线衍射数据显示几乎没有缺陷[42]，分辨率为1.62?。此外，在CSC 温度程序下生长的晶体抗辐射损伤能力增强，在连续曝光下，可衍射长达45 个小时。但是，这种方法的局限性是需要大多数蛋白质的物理化学数据。
2.2 变温提高结晶筛选成功率
与恒温相比，在一个合理范围内变化温度可以增加结晶筛选的成功率。Zhang 等人[17]
采用温度循环策略（CTS: Cycling Temperature Strategy）研究了蛋白质结晶筛选成功率。变温程序如（a）所示[17]。首先温度用t1 时间从T1 线性增加到T2，然后用t2-t1 时间从T2线性减小到T1。在这项研究中，温度增加和降低的速度相等，t2=2t1。其中T1=277K，T2=303K，t2=48h。对照实验中恒温为277 K。
（b）[17]显示了多种蛋白质在CTS 程序下结晶条件筛选成功率得到提高的结果。当蛋白质适合的结晶温度未知时，CTS 程序可用于提高结晶筛选的成功率。
3 结束语
生长高质量蛋白质晶体一直是结构生物学领域的瓶颈问题之一。在众多影响蛋白质结晶的因素中，温度控制是至关重要的，但一直以来没有受到广泛重视。本文总结了恒温（最佳结晶温度）和变温对蛋白质结晶的影响。由于蛋白质的特异性，每种蛋白质的最佳结晶温度有很大差异，有必要对温度进行筛选，这既有利于寻找到结晶条件，也有利于生长高质量蛋白质晶体。而变温既可以用于生长高质量蛋白质晶体，当蛋白质的结晶温度未知时，在蛋白质结晶筛选过程中，变温也可以用来寻找结晶条件。因此，通过适当的温度控制，可以显著提高蛋白质结晶筛选成功率及蛋白质晶体质量。可见，在蛋白质结晶过程中，对温度的控制是不容忽视的。
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