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脂肪源干细胞上皮分化浅说在喉组织工程中的应用
脂肪源干细胞上皮分化在喉组织工程中的应用
声带瘢痕是一个较难解决的临床问题，尚缺乏有效的治疗手段，目前其主要的治疗方法是向声带中注射填充物或细胞，试图恢复声带浅层的振动性。声带振动受损主要是由于固有层细胞外基质的中断、胶原沉积增多、弹性纤维的丢失等引起。有证据表明声带注射细胞或基质对恢复声带黏膜波的作用是有限的。另外，从人的声带中获取成纤维细胞比较困难。现有的组织工程方法是将声带的成纤维细胞包被在一系列的支架上。用自体细胞来源的组织结构工程代替声带被覆黏膜可能成为严重声带瘢痕的治疗方式。实现该目标的第一步是构建类似于声带固有层和上皮层的三维细胞群基质。切除声带瘢痕后，用新的有组织结构的细胞外基质和上皮作为替代物，改善声带的振动功能。
本研究便是介绍一种新的组织工程方法来构建声带被覆黏膜的替代物，以便恢复声带固有层和上皮的振动功能。通过脂肪抽吸分离获得的脂肪源干细胞是一种多功能干细胞，作为一种自体间质细胞的来源，已被广泛用来产生软骨细胞、成骨细胞和纤维细胞。脂肪源干细胞与骨髓源间质干细胞具有相似的遗传特征，可以分化成外胚层和内胚层细胞。本研究假设脂肪源干细胞在气体界面和特异性细胞因子的作用下可以分化成上皮细胞，而远离气体界面的细胞则可以分化为成纤维细胞。其方法是从UCLA血库获取冷沉淀物，一7O℃保存备用。将解冻的冷沉淀物、牛凝血酶溶液以及细胞悬液按4：1：1混合形成纤维蛋白一脂肪来源的干细胞胶。在Transwell培养基板上形成凝胶，将一定量的细胞悬液直接加在胶上形成气体界面。
可见在特定的生长因子和气体界面的培养下，整个三维培养基中可见胶原产生，在接近上皮层的细胞中胶原沉积较多；在表皮生长因子和气体界面培养下，E一钙黏蛋白(一种上皮细胞标志物)在三维培养基中阳性表达；在表皮生长因子和气体界面下培养8天后，培养基表面的细胞中细胞角蛋白呈阳性表达；在表皮生长因子的作用下培养14天后，接近气胶交界的细胞会出现较多的E一钙黏蛋白表达，包埋在基质中的细胞则无E一钙黏蛋白的表达，而波形蛋白阳性表达较明显。波形蛋白是一种在间质细胞系中表达的细胞骨架蛋白，声带固有层中的成纤维细胞阳性表达波形蛋白。在三维培养基中表达波形蛋白的细胞位于表达E一钙黏蛋白细胞的深层。
本研究构建了声带黏膜的组织工程替代物，三维的纤维蛋白和脂肪源干细胞的水凝胶与声带的固有层和黏膜层有着相似的显微结构和特性。在本研究中，成人脂肪源干细胞可以双向分化成上皮细胞和间质细胞系，并且具有组织结构，表皮生长因子和气体界面是上皮分化的必备条件。本研究结果初步表明，利用组织工程制作声带替代物是可行的。
应用肝细胞生长因子凝胶修复慢性声带瘢痕
慢性声带瘢痕(chronic vocal fold scar)一般继发于喉部创伤、炎症或者手术之后，由于声带固有层组织结构破坏而使声带生物力学功能发生改变，可导致声门功能障碍和严重的发声困难。以往组织学研究发现，声带瘢痕存在细胞外组织结构的改变，如：I型胶原沉积物密集或者紊乱，弹性蛋白和核心蛋白多糖减少，纤连蛋白增加以及透明质酸(hyaluronic acid，HA)降低等。这些组织学变化说明慢性声带瘢痕中成纤维细胞的表型合成异常，从而导致声带组织僵硬，因此，若使声带瘢痕恢复振动功能，改变纤维母细胞的表型以及修复细胞外基质结构是必需的。
肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)是一种多功能的多肽，其在胚胎形成、血管生成、器官重建和创伤修复方面起重要作用。HGF具有抗纤维化功能，在动物模型的研究中已证实其对肝、肾、肺的纤维组织具有预防纤维化及溶解纤维组织的作用。另有研究表明HGF具有治疗声带瘢痕的作用，其可增加成纤维细胞中透明质酸的产生并降低胶原沉积。
以往研究表明HGF对声带急性损伤具治疗作用，但存在HGF在声带注射位点扩散过快、存留时间太短的缺点。本研究建立一种新型的凝胶药物释放系统(drug deliverysystem，DDs)以减缓HGF在声带内的释放、扩散，并通过犬动物模型观察HGF—DDS对慢性声带瘢痕的修复作用。
实验用水凝胶由戊二醛和酸明胶交联化学反应而获得，将1 gg的HGF加入水凝胶中制备成HGF水凝胶。选用8只米格犬作为实验对象，在直达喉镜下将一侧声带固有层撕剥达肌层使声带瘢痕化，对侧声带作为正常对照。6个月后，将0．5 ml HGF水凝胶(含HGF 1 ug)液通过经口声带注射器注入实验组4只犬的瘢痕声带上皮下(HGF治疗组)；另将0．5 ml PBS水凝胶液(含PBS 1 g)注入另四只狗的瘢痕侧声带内(对照组)，1个月后再注射1次以强化疗效。
术后9个月所有犬安乐死，取喉体进行声带振动检测及组织学检查。应用压力传感器检测声门下压力，通过高速数字图像系统记录声带振动状态，以发声压力阈值(pho—nation threshold pressure，PTP)评估声带黏膜振动，并经公式计算振幅率(amplitude ratio，AR)及标准声门间隙(normalizedglottal gap，NGG)。光学显微镜下观察每侧声带固有层胶原、弹性蛋白及透明质酸，通过检测固有层厚度判断瘢痕收缩程度。
振动学检查结果表明：HGF治疗组声带黏膜振动明显好于对照组，对照组损伤侧声带呈弓形并且黏膜振动受限。
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