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探研富血小板血浆在口腔组织再生中应用的影响因素
富血小板血浆(platelet—rich plasma，PRP)是从20世纪60年代用于止血治疗开始应用于临床，1998年Marx首次把PRP与自体髂骨结合应用于下颌骨缺损重建治疗中。目前，富血小板血浆定义为利用离心技术使得少量血浆中自体血小板浓缩，并通过凝血酶和CaC1，的激活使得血小板中的仪链释放其含有的生长因子和黏结蛋白，其同义词包括血小板凝胶、富生长因子血浆、富血小板纤维等。本文对PRP在口腔组织再生中应用的影响因素做一综述。
1 PRP
1.1 PRP中的生长因子和黏结蛋白储存于血小板a链中的生长因子包括血小板衍生生长因子 (platelet—derived growth factor PDGF)、转化生长因子B(transforming growth factorbeta，TGF.B)、血小板衍生血管生成因子(platelet—derived vascular growth factor，PAGF)、血小板衍生上皮生长因子(platelet—derived epidermal growthfactor， PDEGF)、l(insulingrowth factor一1，IGF一1)、血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)等。体外实验也证实PRP中还含有3种黏结蛋白， 即纤维蛋白原、纤维连接蛋白、玻璃粘连蛋白，这三种分子可作为骨或结缔组织的基质。也可作为细胞间的连接分子并以此起着骨诱导的作用。
1.2 PRP的制取方法
随着设备和技术的改进，目前各种PRP制取系统都是采用相类似的机制。其流程可简述为：
①一般从病人前臂静脉中采集少量全血(用于牙周组织再生治疗的全血量为8～10 mL.用于颌骨重建治疗的全血量为8～500 mL)。
② 低转数离心分离：分离出含血小板与红细胞的上清液及去血小板血浆(platelet poor plasma，PPP)，弃除去血小板血浆。
③ 高转数离心分离：红细胞与比重大的PRP分离，去红细胞。
④ 激活并形成凝胶状：添加自体或异体凝血酶和CaC12.
1.3 组织再生中PRP作用机制
富血小板血浆作用的发挥在于其所含的大量生长因子和蛋白在受区的持续性释放。这是冈为这些来自 链的多肽分子能够调控细胞的迁移、附着、增殖、分化.并通过与特定的细胞表面受体结合进而促进胞外基质的堆积，并以此能够模拟伤口的生理性愈合过程以及组织的修复过程嗍。基于这些理论，PRP能够促进移植物的内环境稳定性和黏结性，改善骨组织和软组织的愈合进而缩短术后愈合时间，此外还可以抵消移植物的吸收。
2 影响PRP在口腔组织再生中应用的因素
尽管理论上认为PRP有利于组织再生.但从现有的相关文章报道可以发现，有关PRP是否有利于口腔组织再生存在很大争议。在动物实验中，Jakse等在羊上颌窦提升模型中发现实验组(T)与对照组(C)的组织切片中新骨形成比例不存在显著差异(T：自体髂骨+PPR;C：自体髂骨);而Ohya等 在兔上颌窦提升模型中证实PRP促进骨形成; 国内学者何家才等在犬下颌骨种植周围缺损模型中也发现.实验组(TCP+PRP)的种植体骨结合率和新骨形成质量明显优于对照组(TCP+生理盐水)。在临床试验中，DOri等发现实验组(T)与对照组(C)问在临床附着水平上无显著差异(T：B—TCP+PRP;C：13一TCP)：Piemontese等证实PRP有助于临床附着水平的增加 通过对文献的回顾，我们发现影响PRP促口腔组织再生实验结果差异的因素可以归纳为两大类：第一类为与PRP相关的因素;第二类为与实验设计相关的因素。
2.1 与PRP相关的影响其作用的因素
2.1.1 PRP巾血小板浓度
Marx最早测算出PRP中血小板浓度平均较术前全血中增加了3.38倍。Weibrich等在比较PRP中血小板不同的浓度对成骨影响的实验巾发现，浓缩度在2～6倍时实验组与对照组在荧光标记的骨量上存在显著差异，但浓缩度在6～11倍时却显示有抑制成骨细胞活性的作用。Weibrich由此也提出当PRP中血小板计数在1×10 / I 时PRP呈现出最好的生物学作用。也有学者提出1x10e/t~L只是PRP促进组织愈合的最低适合度。目前，对于组织再生有良好临床作用的最佳血小板浓缩度仍不是很清楚.不过已经明确的是：PRP中血小板浓度较低其促组织再生作用将欠佳，如果浓度过高其促组织再生的作用将受抑制 。JlL~b，有学者认为基于最初全血中血小板数不同，PRP中血小板浓度也将随着变化。但是Weibrich通过实验发现，血小板数或生长因子水平在全血和PRP之间不存在相关性 。
2.1.2 PRP促组织再生作用的持续时间
由于血小板的半衰期仅为8～12 d，有学者提出PRP在早期有促进骨形成的作用，但随时间推移这种作用将会减弱或者消失[17.181：有实验结果支持此观点：@Thor等 1有关上颌窦提升术骨移植的成骨性实验发现，术后3个月PRP组与对照组在新骨形成量上存在明 差异.但在术后6个月两组问就已无显著差异;⑦Harnack等[羽有关PRP在牙周手术中应用的随机对照实验发现.伤口愈合指数在术后3 d时比较高，但从术后2周起开始下降。
2.1.3 制取PRP 的不同方法
早在2001年Zimmermann等通过实验发现，PRP中血小板浓度随不同制取方法而存在明显差异。Weibrich等f6l认为目前PRP制取方法大致分为梯度密度细胞分离法和‘uffv coat’(白细胞层)法，并指出与 uffv coat’(白细胞层)法相比梯度密度细胞分离法产生的血小板数多，生长因子水平高。Weibrich等 比较了PCCS (浓缩血小板采集系统，platelet concentrationc0liection system)与Curasan(eurasan PRP kit)两种不同的PRP制取系统，并发现PCCS系统产生的血小板数更多，TGF—B与IGF I的浓度更高。
2.1.4 PRP的激活物—— 凝血酶
目前，用于PRP激活的凝血酶主要为两种来源：一种为自体获取的人凝血酶：另一种为异种来源的凝血酶，多为牛凝血酶。Su等 分别用人凝血酶和牛凝血酶来制备PRP胶.发现使用人凝血酶制成的PRP其PDGF和TGF浓度高于用牛凝血酶制成的。
2.1.5 PRP生长凶子的双重性作用
PDGF和TGF.B都具有刺激或抑制成骨细胞的作用。此外由于PRP内含多种多肽类因子，每个因子对同一组织都有着不同的作用或应答，并相互作用，进而形成多种信号分子级联表达途径，最终导致基因的表达和蛋白形成。在一动物模型中，虽然TGF.p在PDGF的激活下被释放，但在组织学中并没有发现纤维组织的形成。
2.1.6 其他再生材料的影响
在口腔骨组织工程中，骨替代材料分为自体骨、同种异体骨、异种骨、异质骨替代材料。其中自体骨是通过骨传导(osteoconductive)和成骨来促进骨愈合，异体骨是通过骨诱导性fosteoinductive)来促进骨形成，异质骨替代材料是通过骨传导性来促进骨愈合。骨传导性材料通过支架的作用来支持自体新骨组织生成并逐渐被替代，而骨替代性材料通过材料或生长因子刺激宿主再生来恢复缺失闭。目前，PRP已与上述各种骨替代材料结合应用于口腔组织再生中。
但有学者指出：PRP不具有骨诱导性，仅有骨传导潜能 ，只有当宿主重要活细胞(成骨细胞和骨细胞)存在时PRP才能促进新骨形成旧。有学者发现，当自体骨不存在或移植材料体积过大时，PRP就无法产生有效的刺激作用[281。这些似乎可以解释PRP与无活力移植材料结合无明显促骨形成作用。PRP中的生长因子对巨噬细胞和单核细胞有趋化作用，实验证实当上述两种细胞在宿主区过多时会引发宿主区组织感染，进而导致B.TCP的早期吸收 。另一动物实验发现骨传导性替代材料可阻碍再生区空间从而阻止牙周组织再生。
2.2 与实验设计相关的影响PRP作用的因素
目前，有关PRP在口腔组织再生中作用的实验部分存在着设计上的缺陷，这些设计缺陷可能会掩盖了PRP在组织再生中的角色。这些与实验设计有关的因素包括病人情况、术后随访期、检查指标等。
2.2.1 人选的病人情况
有无影响实验的系统病史，口腔卫生情况，有无吸烟史，骨缺损的类别，疾病的严重程度等都会影响实验的结果。在牙周治疗中，垂直骨缺损越多，临床附着水平增加也越多。一些实验证实，经牙周常规和再生治疗后菌斑控制是影响牙周组织愈合的重要因素之一。
2.2.2 术后随访期
有两个有关白体髂骨与PRP结合运用的实验.以术后4个月为随访期的实验得出PRP有利于成骨，以术后6个月为随访期的实验却得出相反结果。这可能与PPR的骨传导性发挥在成骨早期有关。但是，长期的评估是更有利于观察实验的临床稳定性。
2.2.3 实验的检查指标
目前.有关上颌窦的实验主要为受植区骨组织学检查，检验指标多为松质骨体积(trabecular bone volume，TBV)、骨体积比、新骨形成比：影像学检查，指标多为骨密度值。有关牙周再生的实验主要为临床检测，检验指标多为临床附着水平(clinical attachment level，CAL)、牙龈退缩(gingival recession， GR)、牙周袋探诊深度(pocketdepth PD) 在一篇有关PRP与脱钙冻干骨移植物结合治疗牙周骨内缺损的RCT(随机双盲对照)试验中，作者发现在术后12个月CAL与PD在实验组(脱钙冻干骨+PRP)与对照组(脱钙冻干骨+生理盐水)间存在显著差异，但GR在两组问无显著差异。
我们知道，临床附着水平的增加不仅与骨形成有关也与纤维结缔组织以及结合上皮形成有关。显然选用CAL做指标时，无法辨别附着水平的增加有多少是由于骨形成的，又有多少是由于结缔组织形成的。Plaehokova等指出组织学评价是对于检验PRP成骨作用所必须的。
2.2.4 其他与实验设计相关因素
实验组与对照组的设计，样本量的大小也可能影响实验的结果。Gunsolley等 指出，在牙周骨内缺损再生治疗的实验中每组样本量至少为30人。样本随机分配不充分，分配隐藏不足或者双盲不完全的小样本实验可能会扩大干扰效果 。
3 结论
本文综述了目前影响PRP在口腔再生实验中结果不相一致的相关因素，发现这些影响因素既有PRP自身的因素也有与实验设计有关的因素。通过这些因素的分析.我们认为只有在完全随机对照双盲的实验条件下，并统一与PRP相关的非生物性因素，才可能发现PRP在口腔再生实验中真正的作用，以期有助于PRP在临床的应用。
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