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RP?HPLC法测定钩藤煎剂中钩藤碱含量及变化
【摘要】 [目的]测定钩藤中钩藤碱在沸水后下煎药法中煎出量及变化规律。[方法]采用RP?HPLC法,Hypersil BDS C18柱，(150mm×4.6mm,5μm)，以甲醇∶水(70∶30)为流动相，流速1.0ml/min，波长254nm，柱温25℃。[结果]钩藤碱在0.19μg～0.95μg范围内与峰面积线性关系良好r=0.9990。[结论]钩藤在沸水后下煎药法中，其钩藤碱在汤药中的含量在11.4min达高峰，其后汤药中钩藤碱的含量逐渐降低。
【关键词】 钩藤;钩藤碱;反相高效液相色谱法
RP?HPLC Method Measure the Contents and The Regularity of Rhychophyline in Ramulus Uncariae Cum Uncis Liu Qinghua, Ge Erning Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine, Hangzhou (310053), China
Abstract：[Objective]To measure the contents of rhychophyline in uncaria,and its regularity of variety with decoction time. [Methods]RP?HPLC method was used.The chromatographic conditions were listed below: Hypersil?BDS C18 column (150mm×4.6mm.5μm), amobine phase composed of metranol?water(70∶30),a flow rate of 1ml /min and wave lengths was 254nm,column temperature was 25 ℃. [Results]In the range of 0.19μg ～0.95μg, the linear was very well between the content of rhychophyline and peak area. [Conclusion]The contents of rhychophyline in decoction reached the peak at 11.4min after uncaria was added in boiling water.
Key words：Ramulus Uncariae Cum Uncis; Rhychophyline; RP?HPLC
钩藤，性味甘凉。具有清热平肝，息风止痉的功效。临床主治头痛、眩晕、惊痫抽搐等症[1]。本文对钩藤采取沸水后下的煎药方法，分时采样，再用HPLC法分别测定在不同时间段钩藤碱在汤药中的含量及变化规律。
1 仪器与试药
美国Waters高效液相色谱仪，484紫外检测器，510泵，浙江大学N2000色谱工作台，甲醇为色谱醇，水为双蒸水。钩藤碱对照品购于上海融禾医药科技有限公司(批号：071209)，钩藤药材购于浙江中强医药有限公司。
2 色谱条件
色谱柱：Hypetsil BDS C18柱(150mm×4.6mm，5μm)，流动相：甲醇∶水=70∶30，流速：1ml/min，检测波长：254nm，柱温：25℃。
3 方法与结果
3.1 对照品溶液制备 精密称取钩藤碱对照品4.75mg，置于10 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得对照品储备液。将对照品储备液按不同比例稀释，分别得质量浓度为47.5μg/ml、38.0μg/ml、28.5μg/ml、19.5μg/ml、9.5μg/ml的溶液，待用。下载论文
3.2 供试品溶液制备 称取钩藤药材15g 备用。取1只200 ml的烧杯加入100ml水，调节电压使电炉处于高温，武火至沸，迅速加入钩藤药材15g，开始计时，于1min开始取样，然后在30min内，每隔2min取1次样，每次2ml，上述实验重复3次，并对应混合3次所取样品溶液，共提取15种待测样品经离心，取上清液，再经0.45μm微孔滤膜过滤过，取续虑液，即得供试品液，备用。
3.3 线性关系考察 精密吸取上述各种对照品溶液各20μl，进样，按上述色谱条件测定，记录色谱图(见图1)，以峰面积y为纵坐标，进样量x(μg)为横坐标，绘制标准曲线，并计算得回归方程为y=1130.1763x-53.1639，r=0.9990(n=5)。结果表明，钩藤碱进样量在0.19μg～0.95μg范围内与峰面积具有良好的线性关系。
A B
A钩藤碱对照品 B钩藤样品1钩藤碱
图1 色谱图3.4 精密度试验 精密吸取钩藤碱对照品溶液20μl，连续进样6次，测定峰面积，计算RSD为1.12%。
3.5 稳定性试验 取同一份供试品溶液分别在0h、2h、4h、6h、8h、16h，测定钩藤碱峰面积，计算RSD为2.78%，表明供试品溶液在16h内稳定。
3.6 重复性试验 称取同一批号(200804)钩藤药材15g6份，在同一温度、加水量及煎药法下，取样处理后，测定钩藤碱峰面积积分值，RSD为2.18%。
3.7 样品含量测定 精密吸取各时间段提取的供试品溶液20μl进样，记录色谱图(见图1)，根据峰面积计算各供试品中钩藤碱含量，以煎药时间为横坐标，样品中钩藤碱溶出量为纵坐标，绘制趋势图(见图2)，以趋势图为基准，采用二次曲线拟合法求得被测溶液中钩藤碱随时间变化方程：y=-0.0079t2+0.1796t+0.3678，微分得dy/dt=-0.0158t+0.1796。当dy/dt=0时，t=11.4。由此得知，在汤药中钩藤碱含量在11.4min达到高峰，其后在汤药中的钩藤碱含量逐渐下降。
图2 钩藤碱含量随煎煮时间的变化规律
4 讨论
4.1 实验中曾考察了甲醇∶水=90∶10、80∶20、65∶35等多种流动相比例，钩藤碱分离效果均不理想或者出峰时间较晚，所需分析时间过长。当采用甲醇∶水=70∶30的比例的时，钩藤碱峰形对称,分离度较理想，被测组份保留时间适中。
4.2 由RP?HPLC分析得知，钩藤在沸水后下煎煮过程中，(1)在汤药中的钩藤碱含量在11.4min达到高峰。(2)煎煮时间在10min时，其钩藤碱的含量达到90%。(3)煎煮时间在13min时，在汤药中钩藤碱含量下降了10%，煎药时间至25min后，汤药中的钩藤碱的含量降至高峰时的50%以下。由以上分析得知钩藤在沸水后下煎煮法中，其煎煮时间最好控制在10min～13min，该煎药时间段内汤药中的有效成份含量会相对较高。以上结果对临床科学合理煎药具有一定指导意义。
【参考文献】
[1] 高学敏.中药学[M].新世纪二版.北京:中国中医药出版社,2007:407?408.
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