PI-103对多药耐药白血病细胞体外作用的研究

PI-103对多药耐药白血病细胞体外作用的研究

【摘要】 目的  研究PI-103对耐药白血病细胞的效果及其机制。方法  四甲基偶氮唑蓝（MTT）法研究PI-103对K562及K562/A02细胞增殖的影响，流式细胞术研究细胞内阿霉素浓度的改变。结果  PI-103能显著抑制两种细胞株的生长，对敏感和耐药白血病细胞株具有相同的抑制效果；PI-103能显著增加细胞内阿霉素的浓度，与阿霉素联用时，能增加阿霉素对细胞的生长抑制作用，但仅有叠加效应而无协同效应。结论  PI-103对于耐药白血病是一种有良好应用前景的药物。
【关键词】 白血病  多药耐药  PI-103
        多药耐药是急性白血病治疗失败的主要原因，其主要机制是P-糖蛋白（Pgp）高表达，将细胞内的化疗药物“泵”出细胞外，导致细胞内药物浓度过低，使白血病细胞呈现出耐药表型。如何绕过Pgp的泵作用，逆转耐药，提高白血病的治疗效果是当前治疗的重要方向。K562/A02是由K562细胞经长期阿霉素诱导和克隆筛选而建立的一个耐药细胞系[1]，能在2μg/ml阿霉素中长期生存，对阿霉素的耐药指数在10以上。它高表达Pgp，是体外研究多药耐药的一个较好的细胞模型。
        PI-103是一种人工合成的PI3K和mTOR特异性抑制剂。PI3K和mTOR是PI3K/AKT/mTOR信号转导途径的重要成员，该信号途径在肿瘤的发生发展中发挥着重要的作用。近年来发现PI-103对黑色素瘤[2]、肺癌[3]、神经肿瘤[4]等多种肿瘤具有抑制作用，显示了较好的抗肿瘤效果。本研究旨在研究它对多药耐药白血病细胞株K562/A02的作用。
        1  材料和方法
        1.1细胞株及培养条件  K562及K562/A02细胞株由浙江大学医学院第一附属医院血液病研究所传代保存。培养基为含10%胎牛血清的RPMI1640（Gibco公司产品），置37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养，K562/A02长期以2μg/ml阿霉素（ADM）加压培养，在实验前2周撤除阿霉素。取对数生长期的细胞进行实验。PI-103购自美国cayman公司。
        1.2MTT法测定细胞增殖：取对数生长期细胞，调整细胞浓度，以1×105个细胞/ml的终浓度接种于96孔培养板，加入不同浓度药物，空白对照组以培养基补足，每孔总体系0.2ml，CO2孵箱内培养24小时（h），加MTT工作液20μl/孔（美国Sigma公司），置CO2培养箱中孵育4h，1000 rpm/min离心，小心吸去上清，加入二甲基亚砜0.2ml/孔，吹打，使紫蓝色甲臜沉淀充分溶解。在酶标仪570nm波长处读取吸光度值（A）。以时间为横轴，A值为纵轴，绘制细胞生长曲线。实验重复三次，设复孔三个，取平均值为最终结果。按下列公式计算细胞增殖率：
        细胞生存率=（A处理组-A空白组）/（A对照组-A空白组）*100%
        细胞生长抑制率=1-细胞生存率 
        1.3流式细胞术测定细胞内阿霉素浓度：将0.2μM的PI-103和/或2μg/ml阿霉素与终浓度为1×105/ml的细胞共同孵育24小时，收集1～5×105个细胞，1000rpm离心5min，弃上清。加入适量冷PBS，细胞重悬，1000rpm离心5min，重复2次。以冷PBS重悬细胞，上机行流式细胞检测。流式检测激发波长488nm，接收波长575nm。细胞内阿霉素浓度高低以荧光强度为计量单位。
        1.4统计学处理  采用t检验，所有数据经SPSS11.5统计软件分析。
        2  结果
        2.1 PI-103对敏感和耐药细胞株的生长抑制作用相同
        我们用MTT法检测了不同浓度PI-103对K562及K562/A02细胞增殖的抑制作用。0.5-5μM的PI-103处理24h后，两种细胞均呈现出明显的细胞生长受抑。而且，细胞的生长抑制呈现出剂量依赖性。此外，在相同浓度的PI-103作用下，两种细胞株的生长抑制率基本相同，差异无统计学意义（P>0.05)。
        2.2 PI-103能增加白血病细胞株对阿霉素的敏感性，但仅有叠加作用
        为进一步了解PI-103与阿霉素是否具有协同抑制白血病细胞增殖作用，我们用0.2μM PI-103与不同浓度阿霉素联合作用于K562细胞及K562/A02细胞，以MTT法观察了药物联用对两细胞的生长抑制效果。结果显示，0.2μM PI-103对K562及K562/A02细胞的抑制率分别为10.5%和16.4%，加用PI-103后，阿霉素对K562细胞的抑制率有所增加，但单用阿霉素组的生长抑制曲线与联用PI-103组的生长抑制曲线几乎平行，说明PI-103联用阿霉素仅有叠加作用，而无协调作用。同样，在K562/A02组，但单用阿霉素组的生长抑制曲线与联用PI-103组的生长抑制曲线几乎平行。说明PI-103联用阿霉素对K562/A02细胞生长抑制作用也仅有叠加作用，而无协同作用。
        2.3 PI-103能增加耐药细胞株细胞内阿霉素的浓度
        为明确PI-103增加细胞对阿霉素敏感性的机制，本实验采用用流式细胞术检测了细胞内阿霉素的浓度。 
结果显示，在K562组，未用PI-103时，细胞内阿霉素荧光强度为87.46±3.46，PI-103处理后，细胞内荧光强度升高为107.31±6.13，差异具有统计学意义（P=0.015）。而在K562/A02组，PI-103使细胞内阿霉素荧光强度由79.09±2.97升高至165.94±6.58，差异具有显著统计学意义（P=0.000）。结果显示PI-103能显著增加细胞内阿霉素的浓度，尤其是在耐药K562/A02细胞中更明显。
        3  讨论
        PI3K/AKT/mTOR信号转导途径是细胞生存和增殖的重要途径，在白血病多药耐药的形成机制中也发挥了重要作用。因而，通过抑制PI3K途径诱导细胞凋亡达到治疗白血病尤其是耐药白血病的目的是一个较好的治疗思路[5]。本研究结果显示，双向抑制剂PI-103能显著抑制白血病细胞的增殖，且不受耐药细胞表型的影响，在耐药细胞及不耐药细胞中发挥同样的抑制生长作用。PI3K/AKT/mTOR信号转导途径抑制剂是一种有良好应用前景的药物。
        本研究发现，在Pgp高表达的细胞株K562/A02中，PI-103能明显提高细胞内阿霉素的浓度，其增加量明显高于敏感株K562。其机制可能是由于Pgp的合成受抑制导致的。Tazzari等报道[6]，多药耐药蛋白P170的表达是受PI3K/AKT/mTOR信号调控的。Pgp合成减少导致阿霉素被“泵”出减少，细胞内阿霉素浓度提高，从而在一定程度上逆转白血病细胞的耐药。

       由PI-103能提高细胞内阿霉素浓度这一结果，作者推论PI-103与阿霉素有联用有协同作用。但令作者感到意外的是，本结果显示，二者联用仅有叠加作用，而无协同作用。这可能与下列原因有关：首先，可能与实验方法的选择有关。本实验采用MTT法研究药物作用后细胞的增殖，结果显示，在2μg/ml阿霉素作用下，K562/A02细胞生长显著被抑制。然而，K562/A02细胞是长期用含2μg/ml的培养基中生长的，仅在实验前2周开始撤除阿霉素培养，因而，该细胞在2μg/ml阿霉素作用下是不会死亡的，只是细胞的生长速度减慢了，细胞并未发生凋亡。联用PI-103后，尽管K562/A02细胞的生长受抑率仅仅是两药的叠加，但细胞凋亡是否有增加，尚不明确，换用流式细胞术检测细胞凋亡率也许有助于得出更确切的结论。其次，是否有其他耐药机制的参与，拮抗了细胞内阿霉素浓度提高所致的杀细胞效应，尚有待进一步的研究。第三，与K562/A02细胞的特性有关。Kojima等[7]发现，在野生型P53存在的白血病细胞中，PI-103与阿霉素有协同作用，而在P53突变的白血病细胞，则无协同效果。以往研究显示，K562细胞存在P53突变，因而，PI-103和阿霉素在K562及其耐药株K562/A02中无协同杀伤白血病细胞的作用。然而，多数白血病原代细胞不存在P53突变。因而，体内应用于病人时，PI-103可能会与阿霉素产生协同效应。
        总之，在体外，PI-103具有抗白血病细胞作用，对敏感和耐药细胞同样有效；它能增加细胞内阿霉素浓度，增加细胞对阿霉素的敏感性。双效PI3K/AKT/mTOR抑制剂是一种有良好应用前景的药物，对PI-103的深入研究，必将为开发研制新的双效PI3K/AKT/mTOR抑制剂奠定坚实的基础。
参 考 文 献
[1]Luan FJ. [Establishment of the multidrug-resistant cell line K562/A02 and its drug-resistant properties]. Zhonghua zhong liu za zhi [Chinese journal of oncology]. 1993 Mar;15(2):101-3.
[2]Lopez-Fauqued M, Gil R, Grueso J, Hernandez-Losa J, Pujol A, Moline T, et al. The dual PI3K/mTOR inhibitor PI-103 promotes immunosuppression, in vivo tumor growth and increases survival of sorafenib-treated melanoma cells. International journal of cancer.  Apr 1;126(7):1549-61.
[3]Zou ZQ, Zhang XH, Wang F, Shen QJ, Xu J, Zhang LN, et al. A novel dual PI3Kalpha/mTOR inhibitor PI-103 with high antitumor activity in non-small cell lung cancer cells. International journal of molecular medicine. 2009 Jul;24(1):97-101.
[4]Schwab J, Antonescu C, Boland P, Healey J, Rosenberg A, Nielsen P, et al. Combination of PI3K/mTOR inhibition demonstrates efficacy in human chordoma. Anticancer research. 2009 Jun;29(6):1867-71.
[5]Martelli AM, Tazzari PL, Evangelisti C, Chiarini F, Blalock WL, Billi AM, et al. Targeting the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt/mammalian target of rapamycin module for acute myelogenous leukemia therapy: from bench to bedside. Current medicinal chemistry. 2007;14(19):2009-23.
[6]Tazzari PL, Cappellini A, Ricci F, Evangelisti C, Papa V, Grafone T, et al. Multidrug resistance-associated protein 1 expression is under the control of the phosphoinositide 3 kinase/Akt signal transduction network in human acute myelogenous leukemia blasts. Leukemia. 2007 Mar;21(3):427-38.
[7]Kojima K, Shimanuki M, Shikami M, Samudio IJ, Ruvolo V, Corn P, et al. The dual PI3 kinase/mTOR inhibitor PI-103 prevents p53 induction by Mdm2 inhibition but enhances p53-mediated mitochondrial apoptosis in p53 wild-type AML. Leukemia. 2008 Sep;22(9):1728-36.

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