对两种凝血酶原提取方法的比较

对两种凝血酶原提取方法的比较

摘要： 目的 比较等电点沉淀法和柠檬酸钡吸附法从猪血浆中提取凝血酶原的纯度。方法 分别采用等电点沉淀法和柠檬酸钡吸附法从猪血浆中提取凝血酶原，凝血酶原经单独钙离子激活得到凝血酶，通过凝血酶效价测定、蛋白质浓度测定，计算出凝血酶的比活性。结果 采用等电点沉淀法提取的凝血酶原经激活后得到的凝血酶比活性为11.01±1.54 U/mg，采用柠檬酸钡吸附法提取的凝血酶原经激活后得到的凝血酶比活性为130.17±12.30 U/mg，经配对T检验，P＜0.01.结论 与等电点沉淀法相比，采用柠檬酸钡吸附法从猪血浆中提取得到的凝血酶原纯度更高。

关键词： 凝血酶原； 凝血酶； 等电点沉淀法； 柠檬酸钡吸附法

凝血酶是参与机体凝血过程的一个重要的凝血因子，在体内以凝血酶原形式存在［1］。20世纪中期开始人们将凝血酶应用于临床，由于其疗效显著，应用也越来越广泛。之后美英日等国从牛血浆中分离出凝血酶应用于临床，并证明将动物凝血酶应用于人体未出现凝血酶抗原性，口服和局部外用时无过敏反应和其他不良反应等，因而目前所使用的凝血酶制剂大多来源于动物血浆，国内采用猪血浆制备凝血酶的报道较多［2］。等电点沉淀法和柠檬酸钡吸附法是两种主要的凝血酶原提取方法［3］，凝血酶原经单独的钙离子激活可得到凝血酶。目前，国内尚无研究比较应用等电点沉淀法和柠檬酸钡吸附法所得到的凝血酶原纯度的差异，哪种方法得到的凝血酶原纯度更高？更适合用于提取凝血酶原?本文对这两种方法从猪血浆中提取凝血酶原的纯度进行了比较。为相关实验中选择合适的凝血酶原提取方法提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
柠檬酸钠抗凝的新鲜猪血浆。
1.2 主要试剂
纤维蛋白原和凝血酶标准品购自美国SIGMA公司，Bradford蛋白质定量检测试剂盒购自美国Bio?Rad。其余试剂均为国产分析纯。
柠檬酸钡吸附法使用的四种溶液分别为，溶液A：1.0 mol/L BaCl2溶液； 溶液B：0.02 mol/L Tris，0.15 mol/L BaCl2，0.10 mol/L NaCl，pH7.4； 溶液C：0.02 mol/L Tris， 0.10 mol/L NaCl，0.20 mol/L Na2EDTA，pH7.4； 溶液D：0.02 mol/L Tris，0.15 mol/L NaCl，pH6.5.
1.3 主要仪器
GE GeneQuant 1300核酸蛋白分析仪。
1.4 方法
1.4.1 凝血酶原提取 将收集到的5份猪血浆按1～5编号，各均分为2份，其中1份采用等电点沉淀法提取凝血酶原，另1份采用柠檬酸钡吸附法提取凝血酶原。
1.4.1.1 等电点沉淀法 猪血浆用蒸馏水稀释10倍，用5 %冰乙酸将其pH调至5.3，4℃静置过夜，3 000 r/min离心15 min，弃上清，沉淀用生理盐水溶解，过滤备用。
1.4.1.2 柠檬酸钡吸附法 猪血浆中加入溶液A，体积比为10∶1，4℃搅拌30 min，静置30 min后，3 000 r/min离心30 min，弃上清。沉淀用溶液B洗涤，3 000 r/min离心15 min，弃上清。重复洗3次。沉淀用溶液C解吸附，4℃搅拌0.5～1h，3 000 r/min离心15 min取上清。上清液用溶液D于4℃透析过夜。3 000 r/min离心15 min取上清液，即为凝血酶原溶液。
1.4.2 凝血酶原激活 用2 % Na2CO3溶液将凝血酶原溶液的pH调至7.1，加入0.25 mol/L CaCl2溶液，使Ca2 终浓度为0.03 mol/L，再用2 % Na2CO3溶液将凝血酶原溶液的pH调至7.1，室温静置2 h，过滤即得凝血酶溶液。
1.4.3 凝血酶比活性测定 根据文献［4］提供的方法配制0.1 %纤维蛋白原溶液。
凝血酶效价测定［4,5］：取凝血酶标准品，用生理盐水配制成效价(U/mL)分别为5、6、7、8、9、10的标准品溶液。另取1×10 cm的塑料试管6支，各加入0.1 %纤维蛋白原溶液450 μl，置37℃水浴预热5 min，再分别取已37℃预热的上述6个浓度的标准品溶液各50 μl，迅速加入上述各试管中，立即计时并摇匀，记录凝固时间。每个浓度测2次，求平均值，做标准曲线。待测样品用生理盐水稀释适当浓度，取50 μl，按标准曲线的测定方法平行测定2次，求平均值，根据标准曲线或回归方程计算样品的效价。
根据文献［6］，采用Bradford法测定样品的蛋白质浓度，以牛血清白蛋白为标准品，每个样本平行测2次，取平均值。根据公式：酶比活性=酶效价/溶液蛋白质浓度，计算凝血酶溶液的比活性。
2 结果与分析
以凝血酶标准品溶液效价 (U/mL)为X，对应的凝固时间（sec）为Y进行直线回归处理，并求得直线回归方程，所得方程式为：Y=62.913?5.994X，r≈0.994 8.将凝血酶样品的凝固时间代入回归方程，即可计算得出样品的凝血酶效价(见表1、图1)。
采用等电点沉淀法得到的凝血酶原经激活后，凝血酶的比活性为11.01±1.54 U/mg，而采用柠檬酸钡吸附法提取得到的凝血酶原经激活后，凝血酶的比活性可达到130.17±12.30 U/mg。其比活性经配对样本t检验统计学分析后，其概率P=3.54×10?5＜0.01，说明两种方法得到的凝血酶比活性有显著性差异，后者约为前者的11.8倍。从两种方法所得到的凝血酶溶液的酶活性和蛋白质浓度分析，造成两者酶比活性差异的主要原因在于凝血酶的纯度差异，凝血酶纯度越高，比活性就越高。等电点沉淀法提取的凝血酶原溶液含杂蛋白较多，需要进一步纯化，以提高酶的比活性。因而，采用柠檬酸钡吸附法从猪血浆中提取凝血酶原大大优于等电点沉淀法，得到的凝血酶纯度较高。
3 讨论

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