BCP/HAFG-rhBMP-2复合人工骨修复骨缺损的实验研究

BCP/HAFG-rhBMP-2复合人工骨修复骨缺损的实验研究

【摘要】 目的 研制理想的能较快修复大段骨缺损的人工骨材料。 方法 将重组骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）/透明 质酸钠 纤维蛋白复合凝胶（HAFG）缓释体系和多孔双相钙磷陶瓷（BCP）结合研制成BCP/HAFG-rhBMP -2人工骨，并分别将BCP/HAFG-rhBMP -2和BCP/rhBMP-2及BCP/HAFG人工骨进行兔桡骨大段骨缺损修复的对比研究。术后分别行大体、放射学、组织形态学及生物力学测试。结果 试验中第12周与第2周相比较，3组碱性磷酸酶（AKP）值下降情况分别为BPC/HAFG-rhBMP-2组降低了65.13%，BPC/BMP-2组降低了71.03%，BPC/HAFG组降低了58.59%。 组织学及扫描电镜观察显示:12周时BPC/HAFG-rhBMP-2组材料已基本被成熟骨组织所代替，新骨结构与宿主骨无差别，而BPC/HAFG和BPC/rhBMP-2组骨小梁结构疏松细小，材料仍未完全被降解，材料与骨组织间形成较大间隙。术后12周时3组材料植入部位骨组织极限抗压强度分别为:BCP/HAFG-rhBMP-2组（538±12.7） N、BCP/BMP-2组（368±24.0）N、BCP/HAFG组（256±8.4） N。BPC/HAFG-BMP-2复合型人工骨较BCP/BMP-2及BCP/HAFG人工骨具 有更强、更持久的诱导成骨活性。结论 BCP/HAFG-rhBMP-2人工骨能更快促进长骨大段骨缺损的修复，是一种较理想的人工骨材料。
【关键词】 骨和骨组织;骨移植;生物力学
　　为寻找理想的人工骨组织材料，本实验将多孔双 相钙磷陶瓷（BCP）同重组骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）/透明质酸钠（HA）和纤维蛋白复合凝胶（HAFG）缓释体系结合，制成BCP/HAFG-rhBMP-2人工骨材料，进行修复长骨大段骨缺损的实验。
　　1 材料与方法
　　1.1 人工骨材料的制备
　　（1）BCP由东南大学材料科学与工程学院生物材 料研究组研制提供。该BCP材料呈白色多孔状结构， 孔道彼此连通，孔径约为300 μm，孔隙率为80%。试 验中将BCP制成长10 mm，直径4 mm圆柱体。
　　（2）BCP/HAFG-rhBMP-2人工骨的制备:在BCP植入前 用特制双管注射器将混有等量rhBMP-2 的HAFG复合凝胶缓慢滴注入BCP，使其在BCP表面涂布均匀。待复合凝胶由流体状变为灰白色半钢性状态时植入缺 损部位。同法制备并植入BCP/HAFG人工骨。（3） BCP/rhBMP-2工骨的制备:利用部分真空吸入法［1］将 rhBMP -2和BCP结合在一起。制成的每支人工骨中约含rhBMP-2 1mg，植入前人工骨在密封包装下环氧 乙烷气体消毒24 h。

　　1.2 实验动物及分组
　　新西兰兔60只，体重2.5～3.2 kg，雌雄不限。随机分为3组:A组为BCP/HAFG-rhBMP-2组;B组为 BPC/rhBMP-2组;C组为BPC/HAFG组。
　　1.3 实验方法
　　用质量分数为3%的戊巴比妥钠（1ml·kg-1 ）静脉麻醉后，每兔随机选用左右侧前肢，经剃毛、消毒，取桡侧切口切开皮肤及皮下组织，显露桡骨干中段，用单片小锯锯下10 mm连带骨膜骨段，然后按组分别植入相应人工骨材料。术后给予庆大霉素10 000 U·kg-1，每日2次肌肉注射，连续注射3d。常规条件下喂养 观察。
　　1.4 大体观察
　　观察动物的饮食、活动、伤口反应，术后第2、4、8、12周分批处死动物并取材，观察植入材料的表面、局部成骨及炎症反应等情况。
　　1.5 X线观察
　　术后第4、8、12周摄片，由3人盲法按照Lane-sandhu X射线评分标准［2］进行评分。
　　1.6 碱性磷酸酶（AKP）活性检测 术后第2、4、8、12周3组各取5只动物，全麻后，从心脏抽血3 ml离心，使用AKP试剂盒行血清AKP活性测定。
　　1.7 桡骨生物力学检测
　　术后12周时，每组各取5个标本及正常桡骨标本 作力学强度测试。以材料植入处为中心截取桡骨长约1.4 cm。经牙托粉两端包埋后，置于MTS-858mini bionixII 型生物力学测试机上进行垂直压缩试验。加载速度为1 mm·min-1 ，最大位移设定3 mm。每隔0.1 s记录一次数据。
　　1.8 组织病理学观察
　　将每次所获取的桡骨标本作好标记置于10%甲醛中固定24 h后，经EDTA脱钙、梯度酒精脱水、石蜡包埋，沿桡骨纵轴连续切片，厚度为6 μm，HE染色，光学显微镜下观察。
　　1.9 扫描电镜观察
　　于术后第2、4、8、12周每组各取3个标本，2.5%戊二醛（pH 7.2～7.4）固定2 h，然后用PBS缓冲液冲洗2次，1%锇酸PBS液固定2h，再用PBS缓冲液冲洗2次，乙腈逐级脱水，真空干燥，表面离子溅射喷金处理，HITACHIS-520扫描电镜下观察标本的超微结构。

　　2.0 统计学处理
　　采用SPSS11.5统计软件包，每组测得的X线评 分、AKP水平及生物力学评分采用方差及SNK分析，统计学显著水平为 α =0.05。

　　2 结 果
　　2.1 大体观察
　　术后动物前肢不能负重，跛行，术后1周恢复正常活动。所有动物切口均Ⅰ期愈合。术后2周时，A、B 组材料植入区有明显骨痂生成，而C组材料外周为纤维结缔组织包裹。术后8周，A组材料已部分降解，新生骨组织的形成量明显高于B、C组。12周A组骨缺损完全修复，而其他组骨缺损处仍可见到未吸收的材料及骨缺损（图1）。
　　BCP/ HAFG-rhBMP-2组骨缺损完全修复，骨皮质塑形良好（左）;BPC/HAFG组材料未完全降解，缺损部分修复（中）;BCP/ rhBMP-2组骨缺损大部分 愈合，仍可见少量未降解材料（右）
　　2.2 组织学观察结果
　　术后2周时，A、B组材料外周新骨开始形成，材料与新骨直接结合，材料内部孔隙中有纤维结缔组织 间充质细胞进入（图2）。C组材料外周为纤维结缔组织包裹，偶见炎性细胞浸润，材料内部可见纤维结缔组织填充。术后4周，各组骨缺损植入体孔隙中均有软骨细胞生成，其中A组软骨细胞量明显高于B、C

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