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肉苁蓉提取物对帕金森病细胞损伤模型的保护作用
作者：王虎, 李文伟, 蔡定芳, 杨茹【关键词】 肉苁蓉; 1?甲基?4?苯基?吡啶离子; 帕金森病; 生存率
帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是中枢神经系统进行性变性疾病。一旦出现临床症状，其黑质纹状体系统多巴胺神经元已经减少了60%～80%。尽管神经科学家采取包括左旋多巴制剂在内的各种治疗方法，但目前所有的研究都提示无法阻止其进展。生长抑制和DNA损伤诱导基因153（growth arrest? and DNA damage?induced gene 153, GADD153）是调控细胞凋亡的一种重要蛋白，在细胞内质网应激等应激状态下大量表达并转位于细胞核［1］。本研究观察了肉苁蓉提取物对1?甲基?4?苯基?吡啶离子（1?methyl?4?phenylpyridinium ion, MPP ）介导的SH?SY5Y多巴胺能细胞系损伤的保护作用及对GADD153表达的影响，并探讨了其对帕金森病的神经保护作用。
1 材料与方法
1.1 材料 肉苁蓉提取物，上海市东方科技公司产品，PBS稀释成10 mg/ml，22 μm滤膜过滤灭菌；MPP ，Sigma公司产品，无菌蒸馏水稀释成4 mol/L；胎牛血清、达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbecco's modified eagle's medium, DMEM）、胰蛋白酶，均为Gibco公司产品；GADD153小鼠抗人单克隆抗体，Santa Cruz公司产品；小鼠抗人β?actin单克隆抗体，Sigma公司产品；甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT），荷兰Duchefa公司产品；反转录试剂盒（reverse transcriptase?polymerase chain reaction, RT?PCR），MBI公司产品；SH?SY5Y细胞，复旦大学神经生物学国家重点实验室黄芳老师惠赠。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养及分组 SH?SY5Y细胞每2～3 d用10% DMEM培养液换液1次。待细胞增长至80%融合时，用0.25%胰酶消化细胞，按1×105分瓶传代，置于5% CO2的细胞培养箱中。实验用细胞分为对照组、MPP 组和肉苁蓉提取物不同浓度组。用DMEM培养液将MPP 按1∶10梯度稀释成400 mmol/L，按1∶100体积比例加入96孔板或6孔板中，使MPP 终浓度分别为0.25、0.5、1、2和4 mmol/L。肉苁蓉提取物用DMEM培养液按1∶10梯度稀释成1 mg/ml与10 μg/ml两个工作浓度。按1∶100加入96孔板或6孔板中，使终浓度分别为1、10和100 μg/ml。6孔板每孔总体积为2 ml，96孔板每孔总体积为200 μl。每项相同实验均重复3次。
1.2.2 MTT检测细胞活性
1.2.2.1 MPP 对SH?SY5Y细胞存活率的影响 1×104密度SH?SY5Y细胞200 μl接种于96孔板，24 h后换含MPP 终浓度分别为0.25、0.5、1、2和4 mmol/L的培养液，每浓度3复孔，置于5% CO2培养箱37 ℃孵育，分别于6、12、24和48 h时各孔加入MTT 20 μl，继续孵育4 h取出培养板。吸弃培养液，每孔加入二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide, DMSO）150 μl充分震荡10 min，待蓝色颗粒完全溶解后用全自动酶标仪（Biorad产品）570 nm处测定吸光度值。
1.2.2.2 肉苁蓉提取物对MPP 介导的SH?SY5Y细胞损伤的影响 终浓度1 mmol/L MPP 与肉苁蓉提取物分别为1、10和100 μg/ml同时加入96孔板置5% CO2培养箱37 ℃孵育48 h。其余步骤同1.2.2.1。
1.2.3 RT?PCR检测GADD153的mRNA表达 终浓度1 mmol/L MPP 与肉苁蓉提取物分别为1、 10和100 μg/ml，同时加入6孔板置5% CO2培养箱37 ℃孵育48 h。取出6孔培养板，PBS冲洗，按Trizol法提取总RNA。取1 μg RNA，按反转录试剂盒说明进行逆转录。聚合酶链反应总体积为25 μl。引物序列为:GADD153上游引物，5’?GCACCTCCCAGAGCCCTCACTCTCC?3’；下游引物，5’?GTCTACTCCAAGCCTTCCCCCTGCG?3’；β?actin上游引物，5’?ATCGTGGGCCGCCCTAGGCAC?3’；下游引物，5’?TGGCCTTAGGGTTCAGA GGGGC?3’。扩增目的产物的长度分别为422 bp和244 bp。94 ℃预变性5 min。循环参数为：95 ℃变性0.5 min，60 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸1 min，共35个循环。取PCR产物4 μl，电泳后拍照。
1.2.4 Western blotting检测GADD153蛋白表达 终浓度1 mmol/L MPP 与肉苁蓉提取物分别为1、10和100 μg/ml，同时加入6孔板置5% CO2培养箱37 ℃孵育48 h。取出6孔培养板，PBS冲洗，加入60 μl蛋白裂解液裂解，超声震荡，100 ℃变性10 min。用Lowry法测定样品蛋白浓度。电泳：积层胶60 V 30min，分离胶120 V 90 min；PVDF膜转膜110 V 100 min。加1∶50小鼠抗人GADD153单克隆抗体，4 ℃过夜。TBST溶液洗涤3次，10 min/次，加含HRP的兔抗小鼠二抗室温孵育2 h，化学发光法显影X胶片。胶片用Alpha Image 950自动扫胶系统得到条带灰度值。每个样本的免疫印迹条带均与同一样本的β?actin比较后作统计学分析。
1.3 统计学方法 采用SPSS 11.5软件进行单因素方差分析。计量资料数据用x±s表示。
2 结果
2.1 MPP 对SH?SY5Y细胞存活率的影响 不同浓度MPP 作用SH?SY5Y细胞后，细胞存活率随MPP 的浓度增加而降低；MPP 1 mmol/L浓度状态下细胞存活率随时间增长而降低。呈现明显的量效与时效关系。见图1。其中MPP 1 mmol/L组在48 h存活率为（45.30±3.21）%，低于50%。故选用1 mmol/L MPP 作为制作帕金森病细胞模型的处理剂量。
图1 不同浓度MPP 对SH?SY5Y存活率的影响（略）
Figure 1 Effects of different concentrations of MPP on cell viability of SH?SY5Y
2.2
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