谈北豆根提取物中有效成分分析方法的建立

时间：2024-09-18 08:05:38 药学毕业论文我要投稿

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谈北豆根提取物中有效成分分析方法的建立

摘要：　目的采用酸性染料比色法测定北豆根提取物中北豆根总碱（ＴＡＭＤ）的含量，采用高效液相色谱（ＨＰＬＣ）法测定蝙蝠葛碱（Ｄａｕｒｉｃｉｎｅ）的含量。方法溴甲酚绿在无水甲醇（ｐＨ＝６）中，可与ＴＡＭＤ直接络合生成绿色化合物，用于比色测定，最大吸收波长为６２０ｎｍ。ＨＰＬＣ法，色谱柱：ＤｉｓｃｏｖｅｒｙＣ１８柱；流动相：乙腈∶水∶磷酸＝１６∶８４∶０．１５；流速：０．５ｍｌ·ｍｉｎ－１；检测波长：２０８ｎｍ。结果酸性染料比色法：线性范围为６～４０ μｇ· ｍｌ－１，r ＝０．９９９８（n ＝７），平均加样回收率为９９．１８％，RSD ＝０．７４％；ＨＰＬＣ法：线性范围为０．０１～０．１ｍｇ· ｍｌ－１，r ＝０．９９９８（n ＝７），平均加样回收率为９８．３２％， RSD＝０．９４％。结论建立的方法灵敏、准确、重现性好，可作为北豆根提取物中ＴＡＭＤ和蝙蝠葛碱的含量分析方法。

关键词：北豆根总碱蝙蝠葛根酸性染料比色法高效液相色谱法
　
　　北豆根为防己科植物蝙蝠葛Menispermum dauricum ＤＣ．的干燥根茎，其有效部位是生物碱。现已知北豆根中含有近２０种生物碱，总碱含量可达１％以上，其中含量最高的生物碱为蝙蝠葛碱，其含量约占总生物碱的５０％左右［１］。北豆根总碱（ＴＡＭＤ）对呼吸道致病菌有抑菌作用，尤其对肺炎球菌效果更为显著。其制剂北豆根片可治疗急性咽炎、扁桃体炎，经过多年的临床应用已收入２００５版《中国药典》。２００５版《中国药典》用酸碱滴定法控制含量，终点不易判断，误差大。本实验采用酸性染料比色法测定提取物中ＴＡＭＤ的含量，采用高效液相色谱法测定提取物中蝙蝠葛碱的含量，从而用这两个指标控制提取物的质量。
　　１　器材

　　ＨＰ－８４５３紫外－可见分光光度计；ＡＧ－２５４型电子分析天平（瑞士梅特勒）；ＷＴ－０２型电热恒温干燥箱（北京恒星医疗器械厂）；ＺＦＱ－８５Ａ型旋转蒸发仪（上海医械专机厂）；Ｒ２００２型旋转蒸发仪（上海申顺科技公司）；ＪＡＳＣＯ高效液相色谱仪（ＵＶ－１５紫外－可见检测器，ＲＵ－１５８０泵，ＣＫＣｈｏｍ色谱工作站，日本）；北豆根饮片（市售，承德产，经鉴定为蝙蝠葛）；北豆根碱（对照品，自制，含量９９．０％）；９５％乙醇、氨水、硫酸、三氯甲烷、无水甲醇、磷酸、酚酞为分析纯；甲醇、乙腈为色谱纯。
　　２方法与结果
　　２．１酸性染料比色法测定提取物中ＴＡＭＤ的含量［２］
　　２．１．１比色原理不吸收可见光的无色物质通过络合、氧化还原等反应生成有色物质，可用于比色测定。实验证明，溴甲酚绿在无水甲醇（ｐＨ＝６）中，可与ＴＡＭＤ直接络合生成绿色化合物，用于比色测定。
　　２．１．２最大吸收波长的选择精密称取蝙蝠葛碱对照品（６０℃干燥至恒重）１０．０ｍｇ置５０ｍｌ容量瓶中，加无水甲醇溶解，最后用无水甲醇定容至５０ｍｌ，作为对照品溶液。

　　精密吸取对照品溶液１．０ｍｌ置１０ｍｌ容量瓶中，加入０．１％溴甲酚绿溶液０．２ｍｌ，用无水甲醇定容，在２００～７００ｎｍ进行扫描，选择最大吸收波长，确定最大吸收波长为６２０ｎｍ。
　　２．１．３显色剂用量的考察分别精密吸取０．１％溴甲酚绿溶液０．１，０．２，０．３，０．４，０．５，０．６，０．７，０．８，０．９ｍｌ置１０ｍｌ容量瓶中，再分别加入对照品溶液１．０ｍｌ，用无水甲醇定容，在６２０ｎｍ处测定吸收度。结果见表１。
　　表1 蝙蝠葛碱与溴酚绿络合后的吸收度（略）
　　结果表明，显色剂用量为０．２ｍｌ时吸收度最大，故选用显色剂用量为０．２ｍｌ。
　　２．１．４显色稳定性的考察以加入０．１％溴甲酚绿溶液０．２ｍｌ的样品为考察对象，在１２０ｍｉｎ内于６２０ｎｍ处测定吸收度，随行试剂空白。结果见表２。
　　表2 蝙蝠葛碱的显色稳定性考察（略）
　　平均吸收度为０．４２３，RSD为０．０３％，表明吸收度在１２０ｍｉｎ内没有明显变化。
　　２．１．５标准曲线的制备分别精密吸取对照品溶液０．３，０．５，０．８，１．０，１．２，１．５，２．０ｍｌ，置１０ｍｌ容量瓶中，加入０．１％溴甲酚绿溶液０．２ｍｌ，于６２０ｎｍ测定吸收度，随行试剂空白。以蝙蝠葛碱浓度C 对吸收度A 进行线性回归，得标准曲线方程：C ＝４９．９１A －０．８８，r ＝０．９９９８（n ＝７），线性范围为６～４０ μｇ· ｍｌ－１。
　　２．１．６精密度实验取２．１．５中的样品（２０ μｇ· ｍｌ－１）测定吸收度，重复测定５次，平均吸收度为０．４２３，RSD 为０．１１％。
　　２．１．７加样回收率实验精密称取北豆根提取物２．０ｍｇ（总碱含量以北豆根碱计为９２．７％），置１０ｍｌ容量瓶中，加无水甲醇使溶解，超声提取１５ｍｉｎ，用无水甲醇定容至１０ｍｌ，总碱浓度以蝙蝠葛碱计０．１８５ｍｇ· ｍｌ－１。蝙蝠葛碱对照品溶液浓度为０．２ｍｇ· ｍｌ－１。分别精密吸取两种溶液各０．４，０．５，０．６，０．８，１．０ｍｌ，一一对应混合于１０ｍｌ容量瓶中，无水甲醇定容。测定结果见表３。
　　表3 TAMD的回收率（略）
　　２．２高效液相色谱法测定提取物中蝙蝠葛碱含量［３］
　　２．２．１色谱条件色谱柱：Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ－Ｃ１８（５ μｍ，４．６ｍｍ ×２５０ｍｍ）；流动相：乙腈∶水∶磷酸＝１６∶８４∶０．１５（V∶V∶V）；流速：０．５ｍｌ· ｍｉｎ－１；波长２０８ｎｍ；柱温：室温；进样量２０ μｌ；理论塔板数２３００。
　２．２．２北豆根对照品、提取物和药材的ＨＰＬＣ的图谱见图１。
　　图1 北豆根对照品提取物和药材的HPLC图谱（略）
　　２．２．３标准曲线的绘制精密称取蝙蝠葛碱对照品（６０℃干燥至恒重）５．０ｍｇ置２５ｍｌ容量瓶中，用流动相溶解并定容，作为对照品溶液。分别精密吸取对照溶液０．５，１．０，１．５，２．０，３．０，４．０，５．０ｍｌ置１０ｍｌ容量瓶中，用流动相稀释至刻度，按上述条件进行检测，以峰面积（Y）对浓度（X）进行直线回归，得回归方程为：Y ＝１．５３ ×１０８ X ＋１．１８ ×１０４；r ＝０．９９９８（n ＝７），线性范围为０．０１～０．１ｍｇ· ｍｌ－１。
　　２．２．４精密度实验选用“

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