前列腺癌中基质金属蛋白酶7，9的表达及其与VEGF的关系

前列腺癌中基质金属蛋白酶7，9的表达及其与VEGF的关系

作者：周洪澜 邢春伟 葛岩 王心蕊 王医术
【摘要】 目的 探讨基质金属蛋白酶7，9在前列腺癌转移侵袭中的作用，以及VEGF与基质金属蛋白酶的关系。方法 采用免疫组织化学和形态定量分析方法分析MMP7及MMP9表达情况，同时培养PC3M细胞并采用Boyden小室侵袭试验及酶谱分析观察MMP9及其与VEGF在前列腺癌中的作用。结果 前列腺癌各分级中MMP7和MMP9的表达均有显著性差异(P＜0?001)。Boyden小室侵袭实验显示，不同试验组穿透Matrigel的细胞数依次递减，即PC3M＞ PC3M MMP9Ab (1∶100)＞ PC3M MMP9Ab (1∶50)，均有显坐的统计学差异(P＜0?01)。酶谱分析观察发现，直接培养于培养皿表面的PC3M 细胞仅有稳定的MMP?9和MMP?2酶原表达，但PC3M细胞与VEGF共孵育组条件培养基中MMP?9酶原含量以VEGF剂量依赖的方式增加。结论 MMP7和MMP9可作为肿瘤侵袭和转移的判定指标。VEGF与MMPs的分泌有关，其机制有待于进一步探讨。
【关键词】 前列腺癌；基质金属蛋白酶；血管内皮细胞生长因子
　　基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMPs）生物学效应贯穿于肿瘤发展的各个环节〔1，2〕。血管内皮生长因子(VEGF)作为一种与肿瘤发生、发展密切相关的生长因子，可通过细胞内信号转导的级联放大效应而调节MMPs的产生与活化〔3，4〕，使得细胞外基质（ECM）处于不断地合成与分解代谢的动态平衡中，这种动态平衡的稳定是维持组织细胞结构和功能的重要基础。本研究以前列腺癌作为研究对象，探讨前列腺癌中金属蛋白酶与肿瘤转移侵袭的关系，以及金属蛋白酶和VEGF的关系。
　　1 材料与方法
　　1?1 材料
　　所有前列腺癌材料取自手术切除的新鲜组织，共计34例，其中5例Gleason Grade 2，9例Gleason Grade 3,14例Gleason Grade 4，6例Gleason Grade5。5例正常前列腺组织取自意外死亡的正常男性青年。所有标本均经严格筛选并经病理诊断证实。体外培养前列腺癌细胞PC3M由吉林大学基础医学院病理生理学教研室惠赠；NIH3T3细胞由吉林大学第三临床学院中心实验室惠赠。
　　1?2 免疫组织化学染色
　　免疫组织化学染色采用链霉素抗生物素蛋白?过氧化物酶连接法（SP法）。所用一抗(MMP7，9，13)、二抗、三抗及DAB均购自迈新公司。步骤如下：梯度脱水、脱蜡，过氧化物酶(A液)阻断15 min，非免疫动物血清(B液)封闭；加入一抗，4℃过夜后；加生物素标记二抗(C液)30 min，滴加链亲和素?过氧化物酶溶液(D液)30 min；DAB发色，水洗终止；苏木精复染细胞核，常规脱水透明，中性树胶封片。
　　1?3 形态定量方法
　　通过Cooled CCD采集预计数视野图片，而后采用Image?Pro Plus Analysis Software分析表达阳性的切片。
　　1?4 细胞培养
　　在含10%新生牛血清和抗生素的IMDM培养液中培养人前列腺癌细胞PC3M。
　　1?5 Boyden小室肿瘤侵袭试验
　　NIH3T3条件培养液的制备：铺Matrigel基膜胶，收集前列腺癌细胞，向小室上室内加入100 μl癌细胞悬液，于37℃，5%CO2条件下孵育4～6 h，醋酸?酒精?甲醛固定液固定20 min，HE染色，中性树胶封片。侵袭细胞的计数：在400×视野下任取10个不重复视野，利用目镜测微尺计数每个视野穿透Matrigel基膜胶下室面的肿瘤细胞数目，计算平均值。
　　1?6 酶谱分析
　　酶谱分析基本步骤：配制含1 mg/ml明胶的10%SDS?PAGE底物；将已制好的浓缩蛋白样品不经加热直接上样；以5 mA/gel电泳，当样品进入分离胶后，将电泳电流提高到10 mA/gel；电泳完成后，将底物胶置于孵育缓冲液中37℃缓慢摇摆18 h，以使待测MMPs充分作用于底物；孵育结束后经考马斯亮蓝染色30 min及脱色液（45%甲醇，10%冰乙酸）脱色60 min，观察结果。利用图像分析软件对酶谱分析结果进行灰度扫描。利用紫外分光光度法测蛋白质含量，每组细胞设3个平行样本，组织酶谱分析重复多次观察。具体步骤：电泳、封胶后，利用图像分析程序，读取图像反转膜式后各消化条带的灰色度及面积，计算各条带的酶含量。酶含量=条带面积×（条带灰度减于背景灰度），将所得值再换算成单位蛋白表达量作为最终测得的酶含量值，从而对各组细胞的酶活性进行定量比较。
　　1?7 统计学处理
　　所有统计均由INSTAT统计软件包完成。两组间均数采用t检验。
　　2 结果
　　2?1前列腺癌中MMP7和MMP9的表达
　　5例正常前列腺组织中，MMP7和MMP9均为3例阳性表达和2例阴性表达。前列腺癌中MMP7和MMP9均阳性表达，其蛋白均主要表达于肿瘤细胞胞浆或胞膜中，部分间质细胞和血管内皮细胞也呈阳性表达（图1），MMP7灰度值为32 047 930±9 499 987，MMP9灰度值为23 873 011±14 414 601。前列腺癌各分级中MMP7和MMP9的表达均有显著性差异(P＜0?001)（图1）。
　　2?2 Boyden小室侵袭实验
　　在Boyden小室的上室内分别加入前列腺癌细胞PC3M，PC3M MMP9Ab (1∶100)，PC3M MMP9Ab (1∶50)，结果显示，穿透Matrigel的细胞数依次递减，即PC3M＞ PC3M MMP9Ab (1∶100)＞ PC3M M

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