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柴胡疏肝散抗肝纤维化的实验研究
作者：付德才 杨世忠 宋祥福【摘要】 目的 探讨柴胡疏肝散对肝纤维化大鼠模型α?SMA、TGF?β1的影响及其抗纤维化的机制。方法 采用40% CCl4皮下注射，制备肝纤维化模型并以柴胡疏肝散干预，测定肝功能、血清透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)及肝组织羟脯氨酸(HYP)，光镜观察肝组织病理变化，免疫组织化学法检测肝组织α?SMA、TGF?β1表达，RT?PCR 检测TGF?β1 mRNA 的表达。结果 柴胡疏肝散组较模型组:肝功能明显改善，血清HA及LN显著降低，肝组织HYP含量明显少，肝组织纤维化程度明显改善，肝组织α?SMA及TGF?β1表达减少。结论 柴胡疏肝散对CCl4 诱导的大鼠肝纤维化有良好的防治作用。
【关键词】 柴胡疏肝散；肝纤维化；α?SMA；TGFβ1
近年来柴胡疏肝散抗肝纤维化的临床研究取得了较好的临床效果〔1〕，但目前国内外尚无柴胡疏肝散抗肝纤维化的基础研究。本实验采用四氯化碳(CCl4)大鼠肝纤维化模型,观察柴胡疏肝散的抗肝纤维化作用,并探讨其对α?平滑肌肌动蛋白(α?SMA)、转化生长因子(TGF?β1)影响及柴胡疏肝散抗肝纤维化的理论机制。
1 材料与方法
1?1 材料
1?1?1 动物及药物 雄性22月龄Wistar 大鼠60 只,体重300～350 g，由吉林大学实验动物中心提供。柴胡疏肝散(柴胡6 g，陈皮6 g，川芎5 g，香附5 g，枳壳5 g，赤芍5 g，甘草3 g，由长春中医药大学附属医院提供) 经冷水浸泡药材2 h，常规两煎,头煎1?5 h，二煎1 h，两次水煎液混合并过滤,经水浴蒸发浓缩成含生药1?12 g/ml的浓缩药液冷藏备用。按体表面积折算,大鼠每天的柴胡疏肝散等效剂量为2?8 g/kg(体重) 。
1?1?2 药品及试剂 CCl4购自北京北化精细化学品有限责任公司)；秋水仙碱(colchicine) 购自昆明股份制药有限公司;谷丙转氨酶、谷草转氨酶试剂盒购自上海科欣生物技术研究所；血清总胆红素(TBIL)试剂盒购自上海科华东菱诊断用品有限公司；透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)放射免疫分析测定盒购自上海海军医学研究所生物技术中心；单克隆急用型鼠抗人生α?SMA试剂盒购自北京中杉生物公司，兔抗大鼠TGF?β1多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，即用型SP免疫组化试剂盒购自福州迈新试剂公司，DAB购自北京中山生物公司，RT?PCR两步法试剂盒购自TAKARA公司，Trizol购自Sangon公司。
1?2 方法
1?2?1 模型制作 参照文献〔2〕方法：实验第1 天除正常空白对照组(对照组) 外,其余动物皮下注射CCl4 分析纯0?5 ml/100 g (体重),以后每隔3 d注射40% CCl4 橄榄油剂0?3 ml/100 g(体重),连续8 w。实验前2 w饲喂高脂玉米粉饲料(79?5%玉米粉 20%猪油 0?5%胆固醇)，第3～6周饲喂100%玉米粉和30%乙醇饮料。
1?2?2 分组及给药方法 将60 只大鼠随机分为4组,每组15只，第1组对照组,饲喂正常饮食;第2组模型组,按上述造模方法给予饮食;第3组柴胡疏肝散治疗组,于造模3 w开始,给予柴胡疏肝散煎剂灌胃,每日2?8 g/kg;第4组秋水仙碱组，于造模3 w开始给予秋水仙碱0?1 mg/(kg·d)-1，共8 w。
1?2?3 标本制作 上述造模及处理过程结束日，禁食12 h后称质量，股静脉取血，分离血清置-20℃保存;并立刻完整摘取肝脏及脾脏，称质量后用生理盐水漂洗肝左叶数次，滤纸拭干后，切取0?2 g置于冰浴中的组织匀浆器内，加入冰生理盐水2 ml，制备成100 g/L肝组织匀浆，4 000 r/min 4℃离心，取上清液保存于-20℃。肝右叶置于40 g/L中性甲醛液中常规固定后，石蜡包埋，用于制作组织芯片。
1?3 检测指标
1?3?1 血清及组织纤维化指标检测 测定血清肝功能包括总胆红素(TBIL)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、白蛋白(ALB)、A/G，检测透明质酸(HA)，Ⅲ型前胶原(PCⅢ)，N型胶原(CN)，层黏蛋白(LN)含量(放射免疫分析法):肝匀浆检测羟脯氨酸(HYP)含量(二甲氨基苯甲醛法)，检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，均按试剂盒说明书操作。
1?3?2 病理检测 组织芯片分别行常规HE染色，Masson三色染色(染胶原纤维)及网织纤维染色，光镜下观察，并根据王泰龄等改进的肝纤维化半定量评分系统(SSS)〔3〕进行炎症活动度及肝纤维化程度计分。
1?3?3 免疫组织化学检查α?SMA、TGF?β1 采用石蜡包埋常规切片,SP法,兔抗鼠TGF?β1,多克隆抗体及鼠抗鼠α?SMA单克隆抗体均以1∶100 稀释,DAB 显色,苏木素复染。PBS 代替一抗作为阴性对照。阳性组织呈棕色，阴性组织呈蓝色?在全自动图像分析系统上，采用HPIAS?2000型图像分析软件进行定量分析，随机选取每张切片10个视野(×400)倍测定阳性细胞的A值与所占视野面积，取其乘积平均值为该组织切片所得值，两项乘积越大表明组织中该抗原含量越高。
1?3?4 RT?PCR检测 大鼠GAPDH 上游引物:5′?CATGACCACAGTCCATGCCATC?3′,下游引物：5′?CACCCTGTTGCTGTAGCCATATTC?3′全长450 bp；TGFβ1 上游引物：5′?TGAGTGGCTGTCTTTTGACG?3′，下游引物：5′?ACTTCCAACCCAGGTCCTTC?3′全长350 bp。α?SMA上游引物：5′?AAGAGGAAGACAGCACAGCTC?3′,下游引物：5′?GATGGATGGGAAAACAGCC?3′称取50～100 mg 肝组织用Trizol 提取总RNA，采用分光光度法测定其含量及纯度，测定A260/A280 值。取2 μg 总RNA，42 ℃逆转录90 min。参数设置94 ℃变性,3 min ×1 循环。94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35 个循环。最后72 ℃彻底延伸7 min ×1 循环。同法扩增GAPDH 作为内参照。取5 μl PCR 产物1?5%琼脂糖凝胶电泳。凝胶图像分析系统检测灰度,TGF?β1/GAPDH 比值表示TGF?β1 mRNA 相对水平。α?SMA/GAPDH 比值表示α?SMAmR2NA 相对水平。
1?4 统计学分析 实验结果计量数据以x±s表示，经SPSS11?10软件包进行方差分析，组间比较采用t检验。
2 结果
2?1
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