探讨RhD阳性血影细胞的制备及应用

时间：2024-07-21 12:31:04 药学毕业论文我要投稿

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探讨RhD阳性血影细胞的制备及应用

摘要:目的：探讨用不同渗透浓度磷酸盐液（PB）制备的RhD阳性血影细胞的抗原性及其在抗-D 抗体分离中的作用。方法：用不同渗透浓度PB作为裂解液，将遗传表现型为CCDee的RhD阳性O型红细胞制备成血影细胞，观察其抗原性；以血影细胞为固相抗原，用亲和层析法从抗D含量为0.814 mg/L的健康人血浆中分离抗-D抗体，检测相关指标。结果： pH7.4、30 mmol/L PB制备的血影细胞形态完整，保持较强的抗原性；成功获得抗-D抗体，回收率达到84.65 ％，IgG单体加二聚体含量为99.3 %，不含抗A、抗B血型抗体以及IgA、IgM和血红蛋白。结论：用pH7.4、30 mmol/L PB制备的血影细胞可作为固相抗原，并能从低效价血浆中分离纯化抗-D抗体。

关键词: RhD抗原抗-D抗体血影细胞血浆

　　　抗-D抗体被广泛用于防止RhD同种免疫[1,2]，同时也用于治疗特发性血小板减少性紫癜[3,4]。目前临床使用的抗-D抗体均为人为免疫而得的血源制剂[5]，而因妊娠等自然免疫而产生的获得性抗D抗体，由于其血液中含量少，没有受到重视而得到利用。2006年用不同渗透浓度的磷酸盐液（PB）制备RhD阳性血影细胞，并探讨其对血影细胞抗原性的影响，探索用血影细胞从含低效价抗-D抗体的血浆中分离纯化抗体的方法及其可用性。
　　1 材料和方法
　　1.1 材料
　　健康人血浆（抗D为0.814 mg/L，IgG含量9.63 g/L，贵州省血液中心），Rh表型CCDee的O型红细胞（贵州省血液中心），效价为1∶256的抗D（IgG）血型抗体标准品（上海市血液中心），溶血素（中国生物制品质量检测所），FITC-兔抗人免疫球蛋白（晶美公司），MININEPHTMIgG抗血清（英国The Binding site公司），99/728抗-D抗体标准品(英国The National Institute for Biological Standards and Control， NIBSC)，免疫单扩散板（上海捷门生物技术合作公司）。8200型超滤器、截留分子量30 kD的超滤膜（美国Millipore公司），3K30型低温高速离心机（德国Sigma公司），FACSCabiber式细胞仪（美国Becton Dickinson公司），高效液相色谱仪（美国Waters公司），MININEPSAN散射比浊仪（英国The Bingding Site 公司）。
　　1.2 血影细胞的制备
　　O型Rh表型CCDee的红细胞，等体积生理盐水洗涤3次（1 000 r/min×5 min，4 ℃），pH7.4，渗透浓度分别为40、30 和20 mmol/L的PB多次洗涤离心（20 000 r/min×15 min，4 ℃）至上清液无色，沉淀即为含D抗原的血影细胞。
　　1.3 血影细胞形态和抗原性检测
　　在光镜下观察血影细胞的形态。将血影细胞与标准抗-D抗体37 ℃孵育30 min，离心取上清液，用RhD筛选细胞测定其抗体效价，标准抗-D抗体效价减去上清液效价反映血影细胞的抗原性，相同条件重复5次。
　　1.4 血浆抗D-抗体的分离纯化
　　血影细胞用2%戊二醛2∶1的体积比固定30 min后与血浆按1∶2的体积比例混合，37 ℃轻柔搅拌2 h，离心（1 000 r/min×5 min，4 ℃）弃上清，沉淀的细胞用10倍体积的pH2.8，0.2 mol/L的甘氨酸－盐酸缓冲液洗脱，离心（ 1 000 r/min×3 min），洗脱液用0.05 mol/L NaOH调pH至6.0～6.5，重复两次，合并洗脱液，超滤浓缩至原血浆体积的1/5，过滤除菌，冷冻干燥，4 ℃保存。相同条件重复7次。
　　1.5 抗体测定
　　终点散射比浊法测定IgG含量，免疫单扩散法检测IgA和IgM含量，高效液相色谱法测定IgG单体加二聚体含量，流式细胞术测定抗-D抗体含量，邻甲联苯胺法行血红蛋白定性测定，试管法测定抗A、抗B血型抗体。
　2 结果
　　2.1 血影细胞的形态
　　用渗透浓度为20 mmol/L的PB制备的血影细胞形态不规则，混有较多细胞碎片；用30和40 mmol/L的PB制备的血影细胞呈透明圆形，未见明显细胞碎片，但40 mmol/L的PB制备的血影细胞内含有少量血红蛋白，细胞中心可见红色。
　　2.2 血影细胞的抗原性
　　抗-D标准品效价为1∶256，表1显示血影细胞与抗-D抗体标准品孵育后，重复 5次的结果。用20 mmol/L的PB制备的血影细胞与抗-D抗体标准品孵育后，四次上清液中的抗体效价为1∶128；而用30和40 mmol/L的PB制备的血影细胞与抗-D抗体标准品孵育后，上清液中的抗体效价在1∶16与1∶32之间。表1 标准抗体与血影细胞孵育后上清液的抗体效价（略）
　　2.3 IgG含量、抗-D抗体含量和回收率
　　用30 mmol/L PB制备的血影细胞对血浆进行亲和层析得到的制剂中，IgG含量为（4.24±1.53）g/L（n=7），其中单体加二聚体占（99.9±0.25）％（n=7）；抗-D抗体的含量为（3.45±0.31）mg/L（n=7），回收率为（84.65±7.85）％（n=7）；7次重复得到的制剂均不含抗A、抗B血型抗体以及IgA、IgM和血红蛋白。
　　2.4 分离纯化过程对血影细胞的影响
　　用30 mmol/L PB制备的血影细胞在2%戊二醛固定后和亲和层析后细胞形态略变小，而经过洗脱液洗脱的血影细胞比固定后的细胞形体稍大，但细胞仍然呈完整圆形，细胞涂片光镜下未观察到细胞膜的碎片。见图1。
　　3 讨论
　　
　　本课题组曾用柱层析法从低效价血浆中分离得到含抗-D抗体的IgG[6]，再用经2 ％戊二醛固定的RhD阳性红细胞从IgG中纯化抗-D抗体。

　　为提高抗-D抗体的回收率，设想直接用RhD阳性红细胞从含抗-D抗体的血浆中分离纯化该抗体。实验发现，戊二醛固定30 min的红细胞与血浆接触后出现血红蛋白溢出现象，延长红细胞固定时间和灭活血浆补体仍不能改善。鉴于RhD抗原仅位于红细胞膜上，参考Litten等[7，8]方法，利用低渗的裂解液将血红蛋白从红细胞中释放出来。结果表明，渗透浓度分别为40、30和20 mmol/L的PB均可使红细胞裂解而释出Hb，成为具有D抗原性的血影细胞。光镜下，用40和30 mmol/L的PB制备的血影细胞呈光滑圆形，未见细胞膜碎片；40

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