- 相关推荐
论Nogo受体拮抗剂对大鼠急性脊髓损伤的保护作用
摘要： 目的 探讨Nogo受体拮抗剂NEP1-40对大鼠脊髓损伤后脊髓功能恢复的影响，为临床治疗急性脊髓损伤提供实验依据。方法 健康Wistar大鼠48只随机分为创伤对照组、NEP1-40治疗组。建立大鼠中段胸部脊髓后半部横切模型。对照组注入生理盐水，实验组采用NEP1-40治疗。分别在术后取材行苏木精-伊红染色、免疫荧光染色检测。术后第1、3天及1、2、3、4周对动物进行运动功能评分。结果 脊髓损伤3周后，NEP1-40组行为学评分高于对照组，同时NeuN/NF-200阳性染色亦明显高于对照组，差异有统计学意义。结论 NEP1-40治疗脊髓损伤能促进神经元的再生，恢复脊髓功能。
关键词： 大鼠；脊髓损伤；Nogo受体拮抗剂；再生
脊髓少突胶质细胞所分泌的Nogo蛋白是目前已知最强的神经轴突生长抑制因子，对受损神经元再生具有极强的抑制作用［1］。Nogo受体拮抗剂(Nogo extracellular peptide, residues 1-40，NEP1-40)为针对Nogo-66氨基序列设计的Nogo受体(Nogo receptor，NgR)竞争性拮抗剂，能拮抗中枢神经抑制因子与NgR的结合，起到促进神经再生的作用［1-2］。本实验主要观察NEP1-40对于急性脊髓损伤大鼠运动功能的影响及对NF-200表达的影响，并进一步探讨NEP1-40治疗急性脊髓损伤的疗效和可能机制。
1 材料和方法
1.1 主要试剂
NEP1-40、兔抗大鼠NeuN 抗体、小鼠抗大鼠NF-200抗体、抗兔IgG-FITC、抗小鼠IgG-RBITC，均购自北京博奥森生物技术有限公司。
1.2 动物及分组
健康成年Wistar大鼠48只(由苏州大学实验动物中心提供)， 雌性，体重250～300 g，随机分为生理盐水对照组、NEP1-40实验组。
1.3 动物模型的制作
参照Brosamle等［3］方法制作脊髓半横断模型。大鼠经腹腔麻醉后固定于立体定位仪上，常规消毒，以第8胸椎(T8)棘突为中心，手术显露棘突。手术显微镜下打开T8椎板，用刀片做T10脊髓的后半横断，损伤深度1.0 mm（横断后侧和后外侧皮质脊髓束）。向尾侧硬脊膜下置入硬脊膜管（PE-10导管，BD公司），盐水冲洗切口，固定硬脊膜管，依次缝合，模型制作完成。
生理盐水对照组通过置管每天注入生理盐水20 μl，NEP1-40组每天用微量进样器注入NEP1-40 10 μl(0.4 μg/μl)。每天分早、中、晚3次注射，每次注射完毕后用10 μl生理盐水冲管，以保证药物进入蛛网膜下腔，连续使用4周。术后人工挤压膀胱排尿，每天3次，直至形成排尿反射。术后3天给予青霉素4万U／只。硬脊膜管外口予无菌保护，定期换药。
1.4 标本的收集和处理
所有动物均分别于脊髓损伤1、2、3、4周时用4%多聚甲醛经左心室-主动脉灌注后取出脊髓组织，灌注液中固定12 h左右，然后放入30%蔗糖溶液中，待组织沉底，冰冻切片机切片，厚度30 μm。
1.5 检测指标
1.5.1 组织学检查
苏木精-伊红染色，观察脊髓的组织学改变。
1.5.2 免疫荧光组织化学双重标记染色
选取脊髓切片经兔抗大鼠NeuN 抗体(1∶500)﹑小鼠抗大鼠NF-200抗体(1∶400)4℃孵育过夜，再用抗兔IgG-FITC(1∶100)﹑抗小鼠IgG-RBITC (1∶100)37℃孵育1 h，封片后用Leica激光共聚焦扫描显微镜观察免疫荧光双标结果。
1.6 运动功能评定
采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)［4］运动评分法。在80 cm×130 cm×30 cm覆盖有防滑纸板的箱子中，每只实验鼠由2名非实验人独自观察4 min，对后肢的运动功能进行评分。0～21分的分级是根据关节的运动、体重的支撑、前后肢的协调和尾的位置等情况而定。0分代表大鼠后肢无运动，21分表示大鼠后肢运动功能正常。BBB评分分别于术后第1、3、7、14、21、28天进行。
1.7 图像分析
免疫组化染色结果采用德国KONTRONIBAS 2.5全自动图像分析系统，在损伤的头尾两侧，分别取10个视野，计算免疫荧光阳性神经细胞数。
1.8 统计学处理
SAS 9.0统计软件对数据进行统计学处理，计量数据用±s表示。2组实验大鼠BBB评分，采用具有一个重复测量的两因素设计的方差分析，比较不同时点指标的变化趋势。2组免疫荧光染色阳性反应的比较采用成组设计资料t检验。检验水准（双侧）：α=0.05。
2 结果
2.1 组织改变
4周时苏木精-伊红染色显示生理盐水对照组出现神经元固缩、坏死、溶解，细胞体积变小；白质中见较多红细胞渗出，髓鞘肿胀和大量空泡；并有炎性细胞浸润和胶质细胞增生。NEP1-40实验组灰质肿胀变形、出血、小胶质细胞增生和炎性细胞浸润均较损伤组轻；白质点状出血，白质中有较多的正常轴突(图1)。
2.2 免疫组化
激光共聚焦扫描显微镜观察到脊髓损伤1、2、3、4周后神经元的胞体和细胞核均增大，胞质和轴突的NF-200免疫染色为阳性，并且与NeuN共定位(图2)。从NF-200染色阳性神经元数目的统计分析可见，脊髓损伤3周后NEP1-40实验组明显高于生理盐水对照组(P
【论Nogo受体拮抗剂对大鼠急性脊髓损伤的保护作用】相关文章：
论急性运动对骨骼肌mTOR信号通路的影响05-10
论隋炀帝在隋唐诗风嬗变中的历史作用05-23
姜黄素对代谢综合征大鼠ICAM08-24
论电磁相互作用与万有引力的统一06-11
重组人生长激素对化疗大鼠外周血象的影响05-29
论悔恨05-07
浅析博物馆在文化遗产中的保护作用论文04-13
高氧对肺损伤患儿的影响研究05-01
论马克思哲学的生存论指向05-29