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γ-谷氨酰转肽酶酶学性质的研究
【摘要】 目的了解地衣芽孢杆菌菌体细胞中γ-谷氨酰转肽酶的一些基础酶学性质。方法 采用溶菌酶法破碎细胞壁，经硫酸铵沉淀后透析得到粗酶后，采用紫外分光光度法测定该酶的酶活力。结果 该酶在25~35℃的温度范围有很好的耐受性，在碱性条件下保持一定的活性，最适反应温度为45℃，最适反应pH值为8.0，Ca2+ 、Mg2+等金属离子在适当浓度时对酶活性有促进作用。结论 本实验为利用该酶转化生产茶氨酸提供了依据。
【关键词】 γ-谷氨酰转肽酶;酶学性质;茶氨酸
Abstract:Objective To understand some basic properties ofγ-glutamyltranspeptidase from Bacillus licheniformis.Methods Lysozyme were used to disrupt the cell wall and ammonium sulfate were used to separate precipitation and dialysis,at last the crude enzyme were obtained. UV spectrophotometry were used to measured the enzyme activity. Results This enzyme was well tolerant to temperature in the range of 25~35 ℃,but in alkaline conditions,it maintained a certain activity,the optimum reaction temperature was 45 ℃ and optimum reaction pH 8.0,generally the appropriate concentration of metal ions,such as Ca2+,Mg2+,had a positive effect on the activity. Conclusion This experiment could be used in production of theanine with γ-glutamyltranspeptidase.
Key words: γ-glutamyltranspeptidase; enzymological property; L-theanine
γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase,γ-GTP,EC 2.3.2.2),又称γ-谷氨酰转移酶,在生物体内广泛存在,是谷胱甘肽(GSH)代谢的关键酶之一。该酶还参与了氨基酸的跨膜转运,可特异性催化γ-谷氨酰基的转移反应[1]。人们对γ-GTP的早期研究局限于该酶在GSH代谢中所起的作用[2]。随着研究的深入,人们对γ-GTP的催化功能和分子结构有了更多的了解,并发现其在临床上可作为肝胆疾病的生物标志,被广泛应用于肝病及其他脏器疾病的诊断和预后检测[3-4] 。近年来,由于生物技术发展突飞猛进,生物催化与生物转化技术在工业生产中逐渐兴起,利用γ-GTP制备系列γ-谷氨酰基类化合物的研究已成为生物催化领域的热点。已有报道利用γ-谷氨酰基化(γ-glutamylization)反应合成了GG-DOPA等多种化合物[5-7]。目前，利用来源于枯草芽孢杆菌、基因工程改造的大肠埃希菌的γ-GTP生产茶氨酸[8] (L-theanine,γ-L-glu-ethylamide)越来越受到人们的关注。该方法利用γ-GTP将L-谷氨酰胺上的γ-谷氨酰基转移到乙胺受体上,催化合成L-茶氨酸。但利用地衣芽孢杆菌发酵所产的γ-GTP转化合成茶氨酸尚未见报道。本文利用实验室筛选的γ-GTP高产菌株地衣芽孢杆菌发酵产酶，并研究该菌株所产的γ-GTP的基础酶学性质，为进一步利用地衣芽孢杆菌所产的γ-GTP生产茶氨酸提供依据。
1材料与方法
1.1主要材料与试剂
菌种：地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)由本实验室筛选获得。试剂：Tris 购自北京普博欣生物公司;L-γ-谷氨酰对硝基苯胺、双甘肽均购自广州威佳科技有限公司;硫酸铵为国产分析纯。
1.2地衣芽孢杆菌的产酶发酵
用接种环在活化好的菌种斜面上刮下一环菌种，将其转入到种子培养基，30 ℃、240 r/min摇床振荡培养16 h。以20%接种量转接于发酵培养基(30 mL发酵液/300 mL三角瓶)中，在30 ℃下240 r/min摇床培养28 h后收集菌体。
1.3γ-GTP粗酶的制备
γ-GTP发酵瓶培养液离心(4 800 r/min,10 min)，弃上清液，用TE缓冲液(Tri-HCl 缓冲液,pH 8.0，10 mol/L)重悬菌体,采用溶菌酶法以及硫酸铵盐析法制备粗酶液。
1.4酶对温度的耐受性
以TE pH8.0为缓冲液，不同温度下保存20 min，测定酶活力[1]。
1.5酶对pH的耐受性
pH2.0采用Na2HP04柠檬酸缓冲液; pH4.0、pH5.0采用NaAc-HAc缓冲液;pH7.0采用磷酸盐缓冲液;pH8.0、pH9.0采用Tris-HCl缓冲液;pH11?0、pH13.0采用甘氨酸-NaOH缓冲液;在25 ℃下保存30 min，测定酶活力。
1.6酶的最适反应温度
以TE pH8.0为缓冲液，分别在不同温度下测定酶活力。
1.7酶的最适反应pH
pH2.0采用Na2HP04-柠檬酸缓冲液; pH4.0、pH5.0采用NaAc-HAc缓冲液;pH7.0采用磷酸盐缓冲液;pH8.0、pH9.0采用Tris-HCl缓冲液;pH11?0、pH13.0采用甘氨酸-NaOH缓冲液，采用酶活测试方法检测酶活力。
1.8金属离子对酶活力的影响
在反应体系中分别加入各种金属离子，终浓度均为5 mmol/L，采用酶活测试方法检测酶活力。
2结果
2.1酶对温度的耐受性
γ-GTP对40 ℃及以上温度的耐受性较差，当温度达到50 ℃时，经过短时间的保存,酶活力基本丧失。但在25~35℃的温度范围有较好的稳定性，特别是在常温下，经过20 min的保藏，酶活力基本未变。因此该酶的保藏条件比较简单，适合工业生产茶氨酸。见图1。[PSc1781;S*2〗图1γ-谷氨酰转肽酶对温度的耐受性Figure 1Temperature tolerance of γ-GTP
2.2酶对pH的耐受性
γ-GTP对酸性环境的耐受性很差，在pH低于5.0时，短时间保存后酶活力基本丧失，而在碱性条件下，最高可以耐受pH11.0的环境而保持较高的酶活力。其中pH8.0是其最佳的保藏pH。因此可以选用pH8.0的缓冲液保存该酶。见图2。 [PSc1782;S*2〗图2γ-谷氨酰转肽酶对pH的耐受性Figure 2Tolerance to pH of γ-GTP
2.3酶的最适反应温度
γ-GTP对温度的适应性很强，在37~55℃以下均具有较高的酶活力，其中在45 ℃时酶活力最高。因此可以确定按照γ-GTP酶活力检测方法得到γ-GTP的最适反应温度为45 ℃。见图3。
2.4酶的最适反应pH值
γ-GTP对酸性环境适应力很差，而在弱碱性条件下表现出较高的酶活力，其中在pH8.0时酶活力最高。因此可以确定按照γ-GTP酶活力检测方法得到γ-GTP的最适反应pH为8.0。见图4。
2.5金属离子对酶活力的影响
在反应体系中加入5 mmol/L的各种金属离子除亚锡离子外均会对酶的活力有促进作用。但在金属离子中，一价金属离子钾离子和钠离子以及三价金属离子铁离子和铝离子的加入对酶的促进作用明显低于二价金属离子锰离子、钙离子和镁离子。另外，添加重金属离子亚锡离子由于会引起蛋白质的变性，致使酶活力消失;有的金属离子如锰离子、镁离子等可较大程度的提高酶活力，这可能是由于这些金属离子会对γ-GTP的活性中心产生影响的缘故。见图5。[PSc1783;S*2〗图3γ-谷氨酰转肽酶最适反应温度Figure 3Optimum reaction temperature for γ-GTP[PSc1784;S*6/7〗图4γ-谷氨酰转肽酶最适反应pH Figure 4The optimum reaction pH for γ-GTP[PSc1785;S*2〗图5不同金属离子对γ-谷氨酰转肽酶酶活力的影响Figure 5Effects of various metal ions on the activity of γ-GTP
在一般情况下，适合的金属离子及适合的浓度会对酶的催化活性产生促进作用，但如果反应体系中金属离子浓度过高，反而会对酶蛋白产生毒害作用。为此，可选择对γ-GTP影响较大的镁离子研究浓度与酶活力的关系。
Mg2+浓度对酶活力的影响比较显著。在低于3.0 mmol/L的浓度范围内，酶活力随着Mg2+浓度的增加而增高，当浓度达到3.0 mmol/L时酶活力最高，此后，酶活力随着Mg2+浓度上升而缓慢下降。由此可见，在图5所涉及的金属离子(除亚锡离子外)虽然在5 mmol/L的浓度下对酶活力均有促进作用，但在不同浓度下有些金属离子也会对酶起到抑制作用。见图6。 [PSc1786;S*2〗图6镁离子浓度对γ-谷氨酰转肽酶活力的影响Figure 6Effects of Mg2+ concentration on γ-GTP
3讨论
地衣芽孢杆菌所产生的γ-GTP在25~35 ℃的温度范围有较好的稳定性，在50 ℃的温度下保存20 min酶活力基本丧失，这为进一步利用该酶转化生产茶氨酸时的温度条件提供了依据。该酶对酸性环境无耐受性，适宜在碱性条件下保存，在pH低于11的碱性条件下保存30 min，酶活力基本无损失。利用γ-GTP生产茶氨酸需要反应体系pH 为10[9]，而该酶在此pH下比较稳定，说明地衣芽孢杆菌所产生的 γ-GTP适合于酶法转化生产茶氨酸。
按照γ-GTP酶活力检测方法得到地衣芽孢杆菌所产γ-GTP的最适反应温度为45 ℃，最适合反应pH为8.0，在金属离子浓度为5 mmol/L的情况下，钾离子、钙离子和镁离子等金属离子对酶的活力均无伤害，其中有些金属离子(Mn2+,Ca2+)的存在对酶活力促进作用较大(见图5)，在酶转化生产茶氨酸选择合适的离子浓度对酶活力的提高有较大的促进作用，如当镁离子浓度为3.0 mmol/L时酶活力提高了55.9%。
本文仅对γ-谷氨酰转肽酶的基础酶学性质进行了初步研究，有关催化动力学常数，以及利用该酶生产茶氨酸的合适工艺条件还有待进一步的探讨。
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