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壁虎醇提物对小鼠肾包膜下移植S180肉瘤的抑制作用
【摘要】 目的观察壁虎醇提物对小鼠肾包膜下移植S180肉瘤的作用并探讨机制。方法建立免疫功能正常小鼠肾囊膜下移植S180肉瘤模型，将40只雄鼠随机分为阴性对照生理盐水组、阳性对照环磷酰胺组(0.1 g·kg-1)、壁虎醇提物高剂量组(2.4 g·kg-1)、壁虎醇提物低剂量组(1.2 g·kg-1)共4组。腹腔注射给药6 d后,杀鼠称量荷瘤小鼠体重，评价药物对小鼠毒性;测量小鼠肉瘤体积，称取移植瘤小鼠胸腺重、脾脏重，计算抑瘤率、胸腺指数、脾脏指数;用SABC免疫组化法检测血管内皮生长因子(VEGF)的表达。结果壁虎醇提物可抑制小鼠肉瘤S180生长,环磷酰胺组、壁虎醇提物高剂量组、壁虎醇提物低剂量组抑瘤率分别为74.5%，77.5%，57.5%，且各组末体重/初体重分别为0.94，1.03，0.99;壁虎醇提物对免疫器官无影响，而环磷酰胺组胸腺指数、脾脏指数与阴性对照组比则有明显的统计学差异(P<0.05);免疫组化显示环磷酰胺组、壁虎醇提物组与生理盐水组比较VEGF蛋白的表达明显减少。结论壁虎醇提物有抗肿瘤活性,其抗肿瘤的部分作用可能通过抑制肿瘤血管的生成而实现 。
【关键词】 壁虎醇提物; 血管内皮生长因子; 肾包膜; S180肉瘤
壁虎又称为守宫、天龙等，为壁虎科动物无蹼壁虎Gecko swinhoana Gunther或其他几种壁虎除去内脏的全体，是传统的咸寒软坚中药，具有祛风、定惊、散结、解毒的功效。大量研究报道壁虎有显著的抗肿瘤作用。本课题组前期实验也证实中药壁虎对食管癌细胞和S180荷瘤小鼠具有确切的抑制作用[1～3]。但壁虎成分十分复杂，究竟是何种成分发挥抗肿瘤作用，目前还不清楚，本课题组从干壁虎中提取得到壁虎醇提物，发现该醇提物可以抑制小鼠肾包膜下移植S180肉瘤生长。
1 材料与仪器
1.1 壁虎醇提物的制备及试剂加工过程：干无蹼壁虎1 000 g粉碎为粗粉，置于4 000 ml Tris-HCl缓冲液中(pH=7.4)，浸泡过夜，超声细胞破碎，11 000 r·min-1离心，取上清，加无水乙醇至终浓度为55%，放4℃冰箱中，每20~30 min搅拌1次，4 h后11 000 r·min-1离心，取上清，真空旋转蒸发回收乙醇，最终冷冻干燥。环磷酰胺注射液(江苏恒瑞医药有限公司)。含15%胎牛血清RPMI-1640 培养液。VEGF免疫组化染色试剂盒(福州迈新生物科技开发有限公司)。
1.2 动物及瘤株试验所用昆明种小鼠由河南科技大学实验动物中心提供(合格证:0001350 )，体质量(26±3) g,均为雄鼠。S180腹水小鼠由河南省医科所提供。
1.3 仪器游标卡尺(广西桂林量具刃具厂);高速冷冻离心机(江苏省太仓市华美生化仪器厂);万分之一电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司);冷冻干燥仪(德国MARTIN CHRIST公司);旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器公司)。
2 方法
2.1 肾包膜下移植S180肉瘤模型建立将S180腹水小鼠抽出腹腔积液离心洗2 次,用无菌生理盐水液稀释成1 ×107 个/ ml的肉瘤细胞悬液。在小鼠右前腋下接种0. 2 ml肉瘤细胞悬液。7 d后，杀鼠取瘤。将腋下接种的S180肉瘤标本, 于超净工作台剪成0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm 大小之瘤块, 置于含10%胎牛血清的RPMI1640 培养液中,冰浴存放备用。小鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠，按0.2 ml/100 g动物体重麻醉小鼠。小鼠取俯卧位,常规消毒后从右侧肾脏部位平行脊椎切开一约1 cm 的切口,托出肾脏。以眼科镊轻提肾囊膜,以自制接种器将S180肉瘤组织小块接种于肾囊膜下。还纳肾脏于体内,分层缝合肌层及皮肤层。
2.2 壁虎醇提物对荷瘤小鼠S180移植瘤的抑制作用观察将40只动物随机分成4组，生理盐水对照组、CTX组、壁虎醇提物高(2. 4 g/kg)、低(1.2 g/kg) 剂量组共4组,每组各10只,根据体重按0.1 ml/10 g自术后开始腹腔注射，CTX组第1天注射1次，其余组均1 d/次，给药6 d后,称鼠重，处死小鼠,打开腹腔, 以游标卡尺测量瘤体长径(a)与宽径(b), 计算瘤体大小(TS)，瘤块生长的△TS值和抑制率：TS= ab2/ 2 △TS= 末体积 - 初体积抑制率( %) = (1- 用药组瘤体变化/ 对照组瘤体变化) ×100%
2.3 药物毒性观察以小鼠被处死前的体重(FBW) 与给药前的体重(IBW) 之比值作为判定药物对荷瘤小鼠毒性的指标。FBW/IBW≥0.80, 则认为所测药物毒性较小。
2.4 壁虎醇提物对荷瘤小鼠免疫器官的影响 按上述方法给药6 d后，处死动物取胸腺，脾脏称重。胸腺指数=胸腺重/体质量，脾脏指数=脾脏重/体质量。
2.5 小鼠S180肉瘤组织病理学变化肿瘤组织用10%中性甲醛固定,石蜡包埋切片,常规HE染色,光镜观察肉瘤组织病理变化。
2.6 VEGF蛋白表达的检测用SABC免疫组化法,操作步骤按照试剂盒说明书进行。VEGF判定与分析：凡细胞浆、细胞膜出现棕黄色颗粒或均质样棕黄色结构者为VEGF免疫反应阳性细胞。免疫组化染色评分标准是：根据着色细胞的比例(染色范围)及染色强度，染色范围(阳性细胞比率)分为0～4级，阴性为0分;阳性细胞1%～25%为1分;25%～50%为2分;51%～75%为3分;76%～100%为4分。染色强度划分为0～3级,阴性为0分;弱阳性为1分;中等强度为2分;强阳性为3分;两者得分相加为最后得分。
2.7 统计方法运用SPSS 统计软件，采用单测t检验。
3 结果
3.1 壁虎醇提物对荷瘤小鼠S180移植瘤的抑制作用及毒性反应环磷酰胺组、壁虎醇提物高、低组抑瘤率分别为74.5%，77.5%，57.5%，与模型组比较有统计学差异(P<0.01)，且毒性反应小。结果见表1表1 各组对小鼠S180肉瘤的抑制作用
3.2 壁虎醇提物对荷瘤小鼠免疫器官的影响 CTX组与对照组相比，胸腺指数与脾脏指数明显降低(P<0.05),壁虎醇提物各剂量组与对照组相比无明显差异，结果见表2表2 各组对荷瘤小鼠免疫功能的影响 3.3 移植瘤组织病理学变化经HE染色后先在低倍镜下观察，然后在高倍镜下(400×)观察,阴性对照组癌细胞大小和形态不一致,细胞染色较深,癌细胞核体积增大,细胞核和细胞浆比例增大，核的大小、形状、染色不一，核染色深。核染色质呈粗颗粒状，分布不均匀，核仁大，数目增多，核分裂相增多，可见不对称性、多极性及顿挫性等病理性核分裂相，且癌组织间微血管丰富;环磷酰胺组有大片的细胞坏死区，壁虎各组均可见不同程度的片状坏死区，瘤组织内及其周围微血管均减少。
3.4 壁虎对小鼠移植S180肉瘤组织VEGF蛋白表达的影响免疫组化结果显示VEGF蛋白在S180肉瘤组织中呈高表达，主要表达于细胞的胞浆和包膜，环磷酰胺组、壁虎醇提物组对VEGF的表达有明显的抑制。结果见表3及图1表3 各组小鼠S180肉瘤组织VEGF蛋白表达
4 讨论
从中药中筛选有效的抗肿瘤药物已成为国际上发现抗肿瘤药物的重要途径，不仅经济，疗效可靠，还可以为设计更为理想的新药提供新的化学结构，成为创制新药的先导化合物。壁虎是中国传统的中药材，具有攻毒疗疮、散结止疼、活血化淤的功效，目前尚未被《中国药典》收入，壁虎在临床被广泛地用于治疗多种疾病，对肿瘤特别是食管癌，胃癌，肝癌等实体瘤具有独特的疗效[4，5]。本实验组提取的壁虎醇提物能显著的抑制小鼠肾包膜下移植S180肉瘤的生长，壁虎醇提物高、低剂量组抑瘤率可达到77.5% ，57.5%。研究同时本研究又对壁虎高、低剂量组的胸腺指数和脾脏指数与对照组进行比较，结果显示无明显差异，而CTX组与对照组比较下降明显。并且由FBW/IBW 结果显示壁虎醇提物的毒性小。为探讨壁虎醇提物抑制肿瘤生长的机制，我们进一步研究其对血管生成的影响。肿瘤组织内血管形成是受机体内促血管生成细胞因子和抑制血管内皮细胞因子相互作用的结果，VEGF是体内促进血管生成的主要的细胞因子[6]。在肿瘤的血管生成过程中，VEGF不仅促进已经存在的血管系统的内皮细胞的生长，迁移和存活，而且还动员骨髓内的内皮祖细胞释放入外周血，抑制VEGF可以降低肿瘤内微血管的生成[7，8]。本实验组进行了VEGF蛋白表达的检测，结果表明与阴性对照组比，环磷酰胺组、壁虎醇提物组VEGF蛋白表达均降低。可见壁虎醇提物抗肿瘤机制并不是通过增加机体的免疫力起作用，其机制可能与降低了VEGF蛋白的表达有关。
图1 各组小鼠S180肉瘤组织VEGF蛋白表达(400×)
目前对无蹼壁虎抗肿瘤的活性成分研究较少。研究表明壁虎含有组织胺类、蛋白质、氨基酸、微量元素，含维生素C、维生素D、脂肪、粗纤维、胡萝卜素等[9]。无蹼壁虎抗肿瘤活性成分含有多种物质，但其抗肿瘤的有效成分究竟是何物，有待结合药物化学进行深入研究, 此外是否存在更多的作用靶点也有待于进一步深入研究。
【参考文献】
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