葫芦茶根中总多酚提取富集工艺研究

葫芦茶根中总多酚提取富集工艺研究

　　【摘要】  目的优选葫芦茶根中总多酚提取富集工艺。方法以总多酚含量为考察指标，采用单因素实验和正交实验结合的方法优选葫芦茶根中总多酚的提取工艺，并优选D101型大孔树脂富集葫芦茶根中总多酚的最优条件。结果优化条件结合工业生产实际，确定其最佳提取工艺条件为30℃，50%丙酮，8倍量溶剂提取3次，4.5 h/次，此条件下总多酚收率大于6%。以D101型大孔树脂对总多酚进行富集，最佳工艺条件为2 BV/h流速，收集6 BV 30%乙醇洗脱液，总多酚含量为77.2%，收率为32.3%。结论 该法能有效提取富集葫芦茶根中总多酚。

　　【关键词】  葫芦茶; 总多酚; 提取; 富集; 正交设计

　　葫芦茶系豆科葫芦茶属植物葫芦茶Tadehagi triquetrum (L.) Ohashi的全草，为民间常用中草药，主产于广西、江西、广东、福建等地[1，2]。本品性凉，味微苦、涩，具有清热解毒、消积利湿、杀虫防腐等功效，临床用于预防中暑，治疗感冒发热、咽喉肿痛、急性肾炎、黄疸肝炎、肠炎、细菌性痢疾、妊娠呕吐等[3]。目前对该植物的化学成分和生物活性的研究已有报道[4~6]，发现其具有抑菌和杀灭椎实螺的作用。我们在研究中发现葫芦茶根中多酚类成分具有较强的杀软体动物作用，因此我们对其富含的多酚类成分的提取和富集工艺进行了考察，旨在提高总多酚的收率，为其综合开发利用奠定基础。

　　1 仪器与试药

　　Unico7200可见分光光度计(尤尼柯上海仪器有限公司);Laborata 4000型旋转蒸发仪(Heidolph公司); BP210S十万分之一电子天平(Sartorius公司);V-560紫外可见分光光度计(Jasco公司)　葫芦茶全草，2006-03采集于广西壮族自治区平南县，经辽宁师范大学陈辰教授鉴定为Tadehagi triquetrum (L.) Ohashi;没食子酸(南京泽朗医药科技有限公司，批号：ZL20090403YG，纯度99.68%);D101型大孔吸附树脂(天津海光化工有限公司);所用试剂均为分析纯;实验用水为蒸馏水。

　　2 方法与结果

　　2.1 总多酚含量测定方法[7~9]

　　2.1.1 标准曲线的绘制精确称取干燥至恒重的没食子酸对照品10 mg，置于100 ml棕色容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取25 ml，置于100 ml棕色容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，得到浓度为0.025 mg/ml的对照品溶液。分别精确吸取没食子酸对照品溶液0，0.5，1.0，1.5，2.0和2.5ml置于10 ml棕色容量瓶中，各加水至5 ml，再分别加入Folin试剂1 ml，用29% Na2CO3溶液稀释至刻度，摇匀，以相应的试剂为空白，30 min后，在754 nm波长下测定吸光度值，以吸光度值为纵坐标，浓度(mg/ml)为横坐标，绘制标准曲线。得回归方程C=3.023A + 0.0405(r=0.999 5)，其线性范围为0.002 5～0.012 5 mg/ml。

　　2.1.2 样品溶液的测定准确称取30.0 g粉碎后葫芦茶根，置于500 ml的圆底烧瓶中，按实验设置的处理条件提取，回收溶剂后冷冻干燥，准确称取待测样品50 mg，用水溶解，置于100 ml 的容量瓶中并定容。摇匀，精密量取10 ml置于100 ml的棕色容量瓶中定容，摇匀，准确量取2 ml于10 ml棕色容量瓶中，按“2.1.1”项下自“各加水至5 ml”起，同法测定吸光度，计算总多酚的含量和收率。

　　2.2 葫芦茶根中总多酚提取工艺优选[10，11]

　　2.2.1 因素与水平 首先对溶媒浓度、提取温度、提取时间、料液比和提取次数进行了单因素实验，确定了各因素最佳条件分别为：60%丙酮，40℃，6 h，1∶8和3次。对各因素进行综合分析，固定提取次数3次，对温度(A)，溶媒浓度(B)，提取时间(C)，料液比(D)进行考察，以总多酚含量为考核指标，按4因素3水平进行L9(34)正交实验。各因素水平安排见表1表1 考察因素及水平水平A温度T/℃B溶媒浓度(%)

　　2.2.2 正交实验设计及结果 按L9(34)正交设计表安排实验，正交设计及实验结果见表2。由表2分析结果可知，在葫芦茶总多酚的提取工艺中，各因素对提取效果的影响程度依次为A>B>C>D，最优水平组合为A1B1C1D2，即最佳提取工艺为8倍量50%丙酮，30 ℃提取3次，4.5 h/次。

　　2.2.3 验证实验精确称取粉碎后葫芦茶根30.0 g(平行6份)，置于500 ml的圆底烧瓶中，加入8倍量50%丙酮，30 ℃提取4.5 h，提取3次。回收溶剂后冷冻干燥。按“2.1.2”项下操作在754nm波长下测定吸光度。6次测定结果，总多酚平均含量为27.34%，总多酚平均收率为6.26%。结果表明确定的工艺条件优于正交实验中的任何一组，且重复性较好，说明确定的工艺合理。

　　2.3 葫芦茶根中总多酚富集工艺优选[12]

　　2.3.1 D101型大孔吸附树脂的预处理取一定量的D101大孔树脂，95%乙醇浸泡24 h，将其装入树脂柱内，先以95%乙醇洗至流出液中加3倍量水后无白色混浊现象，改用蒸馏水冲洗至无醇味，备用。表2 正交设计及实验结果　　2.3.2 静态吸附量的确定在250 ml的锥形瓶中加入5 g预处理后的D101大孔吸附树脂以及100 ml样品溶液(浓度为9.36 mg/ml)。室温条件下振荡24 h，取上清液测定总多酚含量。计算物料平衡吸附量：q = (C0-C)V/G，式中C0和C分别是初始和平衡时溶液中总多酚的浓度(mg/ml)，V为供试品液的体积(ml)，G为树脂量(g)。计算得D101树脂对多酚的静态吸附量为27.82 mg/g。

　　2.3.3 动态吸附量的确定取30 g预处理后D101大孔树脂装入内径为2.5 cm的树脂柱，取浓度为10.33 mg/ml的葫芦茶根50%丙酮提取液，以2BV/h的流速连续通过树脂柱，收集流出液，每30 ml收集1个洗脱馏分，测定每个洗脱馏分中总多酚浓度。结果表明，当上柱样品溶液加至300 ml时，D101大孔树脂吸附达到饱和。

　　2.3.4 D101树脂洗脱条件的选择洗脱剂浓度的考察：取30 g经预处理后的D101大孔吸附树脂装柱，取5 g葫芦茶根50%丙酮提取物，用水溶解，过滤，以2 BV/h的流速上柱，吸附完全后用蒸馏水及10%，30%，50%，95%乙醇，以2BV/h流速进行洗脱，收集每个梯度洗脱液，浓缩干燥并进行含量测定。结果见表3。结果表明，10%和30%乙醇洗脱液中总多酚含量高，收率为33.0%，所以选择用水及30%乙醇进行洗脱。表3 洗脱剂浓度对洗脱量的影响洗脱剂洗脱量m/mg总多酚含量(%)收率(%) 　　洗脱剂用量的确定：分别用水、30%乙醇对已饱和吸附的D101大孔吸附树脂(柱体积为30 ml)进行洗脱，分别用去离子水5个柱体积，30%乙醇8个柱体积进行洗脱，测定每个洗脱体积中多酚的含量。结果见表4从表4可以看出，水洗脱过程中从第2个柱体积开始洗脱液中总多酚的含量大于50%，30%乙醇洗脱过程中从第7个柱体积开始洗脱液中总多酚的含量小于70%，为富集葫芦茶根中多酚，所以选用1BV的水洗脱后用6BV的30%乙醇洗脱采用洗脱条件为1BV的水洗脱，6BV的30%乙醇洗脱，洗脱流速为2BV/h，葫芦茶根中总多酚富集在30%乙醇洗脱液部分，富集物中总多酚含量为77.2%，收率为32.3%。表4 洗脱剂用量的影响水洗脱洗脱体积编号多酚含量(%)

　　3 讨论

　　在对葫芦茶根杀软体动物实验中发现其具有较强的杀软体动物作用，经化学成分分析发现其富含多酚类成分[9]，因此我们对葫芦茶根中富含的多酚类成分的提取和富集工艺进行了优化。确定了最佳提取工艺条件为30℃，50%丙酮，8倍溶剂提取3次，4.5 h/次，此条件下总多酚收率大于6%。以D101型大孔树脂对总多酚进行富集，最佳工艺条件为2 BV/h流速，收集6 BV 30%乙醇洗脱液，总多酚含量为77.2%，收率为32.3%。D101树脂对葫芦茶多酚的吸附容量大，吸附性能稳定，吸附柱可按比例放大用于工业富集葫芦茶多酚。

【参考文献】

   　[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京:科学出版社,1995.

　　[2] 江苏新医学院.中药大辞典(下册)[M].上海:上海科学技术出版社,1985.

　　[3] 全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编(上册)[M].北京:人民卫生出版社,2000.

　　[4] 文东旭,郑学忠,史剑侠,等.葫芦茶化学成分的研究(Ⅰ) [J].中草药,1999,30(4):252.

　　[5] 文东旭,陆敏仪,唐人九,等.葫芦茶化学成分的研究(Ⅱ) [J].中草药,2000,31(1):3.

　　[6] 李树荣,李琦华,张 菁,等.葫芦茶对椎实螺的杀灭实验[J].中兽医学杂志,2003，1:3.

　　[7] 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部[S].北京：化学工业出版社，2005.

　　[8] 吴小娟,林红景,唐 玲,等.山茶种子抗骨质疏松有效部位群化学成分的含量测定[J].中南药学,2007,5(2): 107.

　　[9] 史丽颖,于大永,冯宝民,等. 葫芦茶根和叶中化学成分定量分析[J]. 中草药, 2009, 40(增刊): 289.

　　[10] 赵子剑,连 琰,陈迪钊. 正交实验优选鱼腥草总黄酮提取工艺研究[J].时珍国医国药, 2008,19(10):2389.

　　[11] 吴国宏,熊何健. 荔枝叶中多酚类物质的提取制备[J].食品科学,2007,28(6):131.

　　[12] 刘 欣,高月娟,王建明,等. 大孔吸附树脂对丁香叶中丁香苦苷的富集工艺研究[J].中草药, 2008,39(11):1655.

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