苯唑西林对金葡球菌ATCC25923青霉素结合蛋白亲和力研究

时间：2023-03-01 08:50:10 药学毕业论文我要投稿

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　　论文关键词青霉素结合蛋白苯唑西林亲和力

　　论文摘要 利用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳、荧光放射自显影术及竞争分析法检测苯唑西林对金葡球菌ATCC25923青霉素结合蛋白的亲和力。结果发现金葡球菌有5条青霉素结合蛋白,即PBP1、PBP2、PBP3、PBP4、PBP5,分子量范围41~87kD。苯唑西林主要与金葡球菌ATCC25923的PBP1和PBP2亲和力强,尤其是与PBP2亲和力很强。由此说明金葡球菌的PBP1和PBP2是苯唑西林的主要作用靶位。

　　青霉素结合蛋白(penicillin-bindingproteins,PBPs)是存在于细菌细胞内膜上一群能同青霉素和其他β-内酰胺类抗生素螯合的细菌蛋白质,即是抗生素作用的靶位点,抗生素与这些靶位点结合后,干扰细菌细胞壁肽聚糖合成而导致细菌细胞溶解死亡。苯唑西林(oxacillin)对金葡球菌具有强大的抗菌作用,对其作用机制的研究,国内未见报道。本文应用微生物生化研究方法,从金葡球菌标准株ATCC25923中提取细菌内膜蛋白,采用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)、荧光放射自显影术及竞争分析法,研究了苯唑西林与金葡球菌标准株ATCC25923细胞内膜青霉素结合蛋白的亲和力,探讨苯唑西林杀菌作用的分子学基础。

　　1 和方法

　　1.1 品及试剂

　　苯唑西林为国家暂行标准品,910u/mg;溶葡萄球菌素(lysostaphin)为Sigma公司产品; -青霉素G钾,比活性Bq/mmol,英国Amersham同位素公司产品;十二烷基硫酸钠、聚丙烯酰胺和Triton X-100, 为Sigma公司产品;PPO(2,5-diphenyl-oxa-zol),瑞士Fluka公司产品;二甲基亚砜(DMSO),重庆化学试剂厂产品;X光片为美国Kodak公司产品。

　　1.2 实验仪器

　　超声粉碎机(Virsonic 300型),美国Vir-tis公司产品;超速低温离心机Beckman L8-60,美国Beckman公司产品;直立式电泳仪,北京六一仪器厂生产;凝胶吸干器(gel slabdryer),英国Bio-Rad公司产品。

　　1.3 菌株

　　金葡球菌标准株ATCC25923,获自中国科学院菌种保存中心。

　　1.4 研究方法

　　1.4.1 增菌

　　将金葡球菌接种于M-H肉汤(pH7.2)25ml中,37℃恒温振荡(速度150~200r/min)孵育16h,再转移至250ml新鲜预热的M-H肉汤中继续振荡4h。于10℃,8000×g离心10min收集菌体,用50mmol/L PBS(pH7.0)洗涤1次,称湿菌量可达1~2g。

　　1.4.2 细菌细胞内膜蛋白质的制备

　　参照文献[1]并作改进。将湿菌悬于2倍体积的50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.5,含10mmol/L MgCl2、0.14mol/Lβ-巯基乙醇、0.5mg/L DNaseⅠ、300mg/L溶菌酶、25mg/L溶葡萄球菌素),37℃,孵育30~60min,然后在冰浴中进行超声粉碎(60s破碎+60s间隔,强度14kHz,共6次),在显微镜下观察细胞破裂情况。7000×g,4℃,离心10min去除未破碎细胞。上清液于100000×g,4℃,离心50min使细胞膜沉淀,沉淀物用400~500μl PBS(pH7.0,含1mol/L NaCl,2% Triton X-100,1mmol/Lβ-巯基乙醇)混匀,放0℃30min,于45000×g,4℃,离心35min,上清液(含细菌内膜蛋白)采用Lowry法[2]测定其蛋白质含量,调节蛋白质浓度为10g/L,分装后放-70℃备用。

　　1.4.3 苯唑西林与-青霉素G竞争性结合

　　参照文献[3]并有改进。在一系列新鲜配制的苯唑西林溶液(0,0.06,0.125,0.25,0.5,1,2,4,8,32,128mg/L)10μl/管中加入膜蛋白20μl(200μg蛋白质)混匀,37℃,孵育10min,然后加入10μl(3.7×104Bq)14C-青霉素G钾继续育10min,最后加入10μl终止缓冲液(3.8%Tris,10%SDS,0.005%溴酚蓝,50%甘油(V/V),25%β-巯基乙醇(V/V),pH7.0)终止反应,煮沸5min,待冷却后作短暂离心,经电泳分离蛋白质。

　　1.4.4 SDS—PAGE

　　使用不连续的垂直电泳法,10%分离胶,5%浓缩胶,每孔加样50μl,电压75~120V,电流20~30mA,电泳4~6h(即溴酚蓝移至距底部约1cm处),凝胶用0.25%考马斯亮蓝R-250染色4h以上,然后用90%甲醇与10%冰乙酸脱色数次。

　　1.4.5 荧光放射自显影(Fluorography)

　　参照文献[4],将脱色的凝胶浸泡于相当于其20倍体积的二甲基亚砜(DMSO)中,1h后更换新鲜的DMSO再浸泡1h。然后凝胶浸泡于相当其5倍体积的22.2% PPO/DMSO中3h,继之置凝胶于蒸馏水中浸泡3h及含10%冰乙酸、1%甘油溶液中浸泡45 min。经凝胶干燥器进行真空干燥。将X光片进行预曝光,其目的是校正样品的放射量与X光片呈现影象的非线性关系。预曝光剂量X线电压40kV,电流50mA,距光源距离50 cm,曝光时间0.02s,即使X光片影象强度增加0.25左右。干燥的凝胶与经预曝光的X光片紧密接触,-50℃低温下曝光50~60d。曝光后的X光片在Kodak X光冲洗机中进行显影、定影处理。

　　1.4.6 最低抑菌浓度(MIC)

　　采用试管二倍稀释法,37℃,孵育16~18h后观察结果,以肉眼观察无细菌生长的最低浓度为MIC。

[1]

苯唑西林对金葡球菌ATCC25923青霉素结合蛋白亲和力研究

　　2 结果

　　2.1 苯唑西林对金葡球菌ATCC25923的MIC为0.25mg/L。

　　2.2 苯唑西林对金葡球菌ATCC25923青霉素结合蛋白的亲和力见Fig.1。从图中可知,金葡球菌标准株内膜蛋白质经荧光放射自显影后可见5条蛋白质条带(即5种青霉素结合蛋白PBP1~PBP5),分子量分别约为87、80、75、70和41kD,与国外文献[5]报道一致。X光片上自显影象强度反应了抗生素与青霉素结合蛋白的亲和力,影象强度越强(即蛋白质条带黑度越深,亲和力越弱,反之,亲和力越强。从图上可见,苯唑西林浓度从0~128mg/L递增时, PBP1和PBP2尤以PBP2影象强度逐渐减弱,即与抗生素亲和力逐渐增加。PBP4在高浓度苯唑西林存在时影象强度减弱。PBP3和PBP5影象强度变化不大。说明金葡球菌PBP1、PBP2尤以PBP2是苯唑西林的主要作用靶位,即是苯唑西林的致死靶位。

　　Fig.1 Competition of oxacillin for PBPsofS.aureusATCC25923a~k:oxacillin concentrations 0,0.06,0.125, 0.25, 0.5, 1,2,4, 8,32,128mg/L respectively

3 讨论

　　早在20世纪40年代已在形态学和生物化学方面对青霉素作用机制进行了初步探索,证明青霉素特异地干扰细菌细胞壁肽聚糖的生物合成。1965年,Wise和Park[6]对经青霉素处理的金葡球菌进行了细致的生化研究,提供了青霉素抑制细菌细胞壁合成过程中交联反应的直接证据,提出了青霉素作用机制经典学说。70年代Spratt等[1]将电泳技术与荧光放射自显影术相结合,建立了青霉素结合蛋白的研究方法。由于青霉素G与所有的青霉素结合蛋白都具有良好的结合,所以目前采用其标记物对PBPs从分子水平上进行探讨。

　　β-内酰胺类抗生素首先同细胞膜上的PBPs结合,这些PBPs具有酶活性,参与细菌细胞壁肽聚糖的合成。肽聚糖主要负责维持细菌细胞壁的完整性,β-内酰胺类抗生素与PBPs结合干扰了PBPs正常的酶功能,使细胞壁正常合成阻断。不同的β-内酰胺类抗生素与不同的PBPs结合,结合后或引起细菌自溶,或形成球形体,或成丝状细胞,最终细菌分裂停止而死亡。本研究表明,敏感的金葡球菌有5种PBPs,2种必需的PBPs(PBP1,PBP2)与苯唑西林具有强大的亲和力。国外对金葡球菌的PBPs已进行了多方面研究[7,8],金葡球菌的PBP1、PBP2、PBP3是抗生素的主要作用靶位,与β-内酰胺类抗生素具有很高亲和力。PBP1可能是原始肽糖转肽酶(peptidoglycantranspetidase),PBP2是静止期细胞具有转肽酶功能,PBP3是一种与分隔有关的转肽酶,PBP4是一种涉及到转辅助肽糖交联的DD-羧肽酶和转肽酶。由于苯唑西林与金葡球菌的2种致死性的PBPs(PBP1,PBP2)具有很高的亲和力,说明苯唑西林对敏感的金葡球菌

　　具有很强的杀菌作用。因此,在上对于非耐性金葡球菌感染仍可选用苯唑西林等β-内酰胺类抗生素治疗。

　　参考文献

　　1 Spratt B G, Pardee A B. Penicillin-binding pro-teins and cell shape inE.coli. Nature,1975;254:516

　　2 Lowry O H, Rosebrough N J, Farr A Let al.Protein measurment with the Folin-phenol rea-gent. J Biol Chem,1951;193:265

　　3 Yan S Z, Bohach G A, Stevens D L. Persistant a-cylaction of high-molecular-weight PBPs by peni-cillin induces the postantibiotic effect inS.pyo-genes. J Infect Dis,1994;170:609

　　4 Georgopapadakon N H, Liu F Y. Penicillin-binding protein in bacteria. Antimicrob AgentsChemother,1980;18:148

　　5 Georgopapadakou N H. Penicillin-binding prote-ins and bacterial resistance toβ-lactams. Antimi-crob Agents Chemother,1993;37:2045

　　6 Wise E M, Park J J. Penicillin: its basis site ofaction as an inhibitor of peptide crosslinking reac-tion in cell wall mucopeptide synthesis. Proc NatlAcad Sci USA,1965;54:75

　　7 Georgopapadakou N H, Dix B A, Mauniz Y R.Possible physiological functions of penicillin-bin-ding proteins inStaphylococcus aureus. Antimi-crob Agents Chemother,1986;29:333

　　8 Mwyke A W, Ward J R, Hayes M Vet al. A rolein vivo for penicillin-binding protein 4 ofStaphy-lococcus aureus. Eur J Biochem,1981;119:389

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