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土霉素片微生物检查方法的验证
【论文关键词】土霉素片；微生物限度检查法
【论文摘要】目的：建立土霉素片的微生物限度检查方法。 方法：采用薄膜过滤法对土霉素片处理后，分别进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证。结果：金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的回收率均大于70%。结论：土霉素片采用薄膜过滤法检查微生物限度方法成立。
Terramycin piece microorganism inspection method confirmation Wang Yanning Guo Lingbo?
【Abstract】Objective:Establishment terramycin piece microorganism limit inspection method. Method: Uses the thin film to filter the law after terramycin piece processing, separately carries on the bacterium, the mold and the saccharomycetes counts the method confirmation.Result：The golden yellow staphylococcus and the white rosary fungus returns-ratio is bigger than 70%. Conclusion: The terramycin piece uses the thin film to filter the law inspection microorganism limit method to be tenable.?
【Key words】Terramycin piece; Microorganism limit inspection method
土霉素是四环素类抗生素，能特异性地与细菌核糖体30S亚基的A位结合，抑制肽链的增长和影响细菌蛋白质的合成，对细菌有广谱抑菌作用。因此其微生物限度检查不能用平皿法，而应采用薄膜过滤法消除其抑菌作用后再检查。
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1.1 仪器：HWS-250型恒温恒湿箱（天津苏瑞科技开发有限公司），集菌仪（杭州泰林生物技术设备有限公司），薄膜（孔径0．22um），康氏振荡器。
1.2 试剂：玫瑰红钠琼脂培养基，营养琼脂培养基，胆盐乳糖增菌培养基，MUG培养基，甘露醇氯化钠琼脂培养基等，均由中国品生物制品检定所提供。
1.3 菌种：阳性对照菌：金黄色葡萄球菌（验证细菌）、白色念珠菌（验证酵母菌、霉菌）；阴性对照：金黄色葡萄球菌（验证大肠埃希菌）。所用菌种均由中国药品生物制品检定所提供；稀释剂及冲洗剂为pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液。
1.4 样品：土霉素片［0.25g（25万单位）］，厂家为河南华利药业有限责任公司，批号为07070601。
2 方法与结果
2.1 细菌、霉菌、酵母菌检查方法验证。
2.1.1 细菌检测方法验证。
2.1.1.1 试验组：取供试品10g，加入pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，于康氏振荡器上振摇10分钟，使片分散，500转、分离心后，分离上清液作为供试液。取上述供试液10ml，加入100ml稀释剂中，薄膜过滤，用冲洗液冲洗2次，每次100ml，第3次冲洗液中加入金黄色葡萄球菌菌悬液0.5ml，薄膜过滤，取出滤膜，面朝上贴于营养琼脂平皿上，35℃培养48小时，计数。
2.1.1.2 菌液组：取金黄色葡萄球菌菌悬液0.5ml,直接接种于营养琼脂平皿上，35℃培养48小时，计数。
2.1.1.3 供试品对照组：取上述供试液10ml,加入100ml稀释剂中，薄膜过滤，用冲洗液冲洗3次，每次100ml，取出滤膜，面朝上贴于营养琼脂平皿上，35℃培养48小时，计数。
2.1.1.4 稀释剂对照组：取稀释液10ml,薄膜过滤，用冲洗液冲洗2次，每次100ml,第3次冲洗液中加入0.5ml金黄色葡萄球菌菌悬液，薄膜过滤，取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂平皿上，35℃培养48小时，计数。
2.1.1.5 上述试验连续做三次，结果如下：?
金黄色葡萄球菌计数后平均值：?
稀释剂对照组菌数：第一次47个，第二次53个，第三次49个；?
菌液组菌数：第一次58个，第二次64个，第三次60个；?
试验组菌数：第一次45个，第二次54个，第三次46个；?
供试品对照组菌数：第一次0个，第二次0个，第三次0个。
2.1.1.6 计算金黄色葡萄球菌回收率。
2.1.1.6.1 稀释剂对照组的回收率:(稀释剂对照组的平均菌落数/菌液组的平均菌落数)×100%?
第一次：47/58×100%=81.0% ?
第二次: 53/64×100%=82.8%?
第三次: 49/60×100%=81.7%
2.1.1.6.2 试验组的回收率:?
[(试验组的平均菌落数-供试品对照组平均菌落数)/菌液组平均菌落数]×100%?
第一次：（45-0）/58×100%=77.6%?
第二次:（54-0）/64×100%=84.4%?
第三次:（46-0）/60×100%=76.7%
2.1.2 霉菌、酵母菌检查方法验证。
2.1.2.1 试验组：取供试品10g，加入pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，于康氏振荡器上振摇10分钟，使片分散，500转、分离心后，分离上清液作为供试液。取上述供试液10ml，加入100ml稀释剂中，薄膜过滤，用冲洗液冲洗2次，每次100ml，第3次冲洗液中加入白色念珠菌菌悬液0.5ml，薄膜过滤，取出滤膜，面朝上贴于营养琼脂平皿上，23℃培养72小时，计数。
2.1.2.2 菌液组：取白色念珠菌菌悬液0.5ml,直接接种于营养琼脂平皿上，23℃培养72小时，计数。
2.1.2.3 供试品对照组：取上述供试液10ml,加入100ml稀释剂中，薄膜过滤，用冲洗液冲洗3次，每次100ml，取出滤膜，面朝上贴于营养琼脂平皿上，23℃培养72小时，计数。
2.1.2.4 稀释剂对照组：取稀释液10ml,薄膜过滤，用冲洗液冲洗2次，每次100ml,第三次冲洗液中加入0.5ml白色念珠菌菌悬液，薄膜过滤，取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂平皿上，23℃培养72小时，计数。
2.1.2.5 上述试验连续做三次，结果如下：?
白色念珠菌计数后平均值：?
稀释剂对照组菌数：第一次56个，第二次60个，第三次53个；?
菌液组菌数：第一次45个，第二次47个，第三次42个；?
试验组菌数：第一次43个，第二次45个，第三次44个；?
供试品对照组菌数：第一次0个，第二次0个，第三次0个。
2.1.2.6 计算白色念珠菌的回收率。
2.1.2.6.1 稀释剂对照组的回收率:
(稀释剂对照组的平均菌落数/菌液组的平均菌落数)×100%?
第一次：45/56×100%=80.4%?
第二次: 47/60×100%=78.3%?
第三次: 42/53×100%=78.2%
2.1.2.6.2 试验组的回收率:
[(试验组的平均菌落数-供试品对照组平均菌落数)/菌液组平均菌落数]×100%?
第一次：（43-0）/56×100%=76.8%?
第二次:（45-0）/60×100%=75.0%?
第三次:（44-0）/53×100%=83.0%
2.2 大肠埃希菌检测方法验证。
2.2.1 试验组：取供试品10g，加入pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，于康氏振荡器上振摇10分钟，使片分散，500转/分离心后，分离上清液作为供试液。取上述供试液10ml，加入100ml稀释剂中，薄膜过滤，用冲洗液冲洗2次，每次100ml，第三次冲洗液中加入大肠埃希菌菌悬液0.2ml，薄膜过滤，取出滤膜，放入100ml胆盐乳糖培养基中, 35℃培养24小时,取0.2ml上述培养物加入5ml MUG培养基中,24小时后,加靛基质试液5滴,液面呈现玫瑰红环。
2.2.2 阴性菌对照组：照上述方法操作，第三次冲洗时冲洗液中加入2ml金黄色葡萄球菌菌液，薄膜过滤，取出滤膜加入100ml胆盐乳糖培养基中，于35℃培养24小时，再取上述培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上，于35℃培养24小时，未发现有金黄色葡萄球菌典型菌落。
3 讨论
3.1 在细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证三次平行试验中，稀释剂对照菌回收率均不低于70%，试验组的菌回收率均不低于70%，照薄膜过滤法可进行土霉素片的细菌、霉菌及酵母菌的检查。
3.2 通过大肠埃希菌检测方法验证，阴性对照组未检出金黄色葡萄球菌，试验组检出大肠埃希菌，按薄膜过滤法可进行土霉素片的大肠埃希菌检查。
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