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来比林对抗庆大霉素耳毒性的实验
作者：郭淑云 孙晓莉 黄维国 刘顺利
【关键词】 庆大霉素/毒性
Lysisin aspirin protects against gentamicin ototoxicity
【Abstract】 AIM: To study the prevention of gentamicin ototoxicity by lysisin aspirin in guinea pigs. METHODS: Fortyeight guinea pigs were divided into 4 groups with 12 each: gentamicin treated group (GM), Lysisin aspirin treated group (LAP), GM+LAP group and control group. Auditory brainstem response and cochlear preparation transmission electron microscope were used to evaluate the effects of hair cells on hearing threshold and the morphology of hair cells. Serum levels of GM were also tested. RESULTS: GM group developed a progressive threshold shift, reaching 50 dB at 8 kHz and the threshold shift in GM+LAP group was 30 dB (P<0.05). Injury in high frequency was significantly more severe than that in low frequency (P<0.01). Morphological results were consistent with the functional results. LAP did not affect serum levels of GM. CONCLUSION: The results suggest that LAP may be a promising therapeutic agent in reducing gentamicin ototoxicity.
【Keywords】 gentamicins/toxicity; lysisin aspirin; drug interactions
【摘要】 目的： 观察来比林对抗庆大霉素耳毒性的作用. 方法： 将豚鼠随机分为庆大霉素（gentamicin， GM）组、来比林组 (lysisin aspirin， LAP)、GM+LAP组及对照组，采用听性脑干反应（ABR）、耳蜗铺片及透射电镜技术、观察用前后听阈及耳蜗毛细胞形态学改变，并检测血清尿素氮、肌苷以及庆大霉素血药浓度. 结果: GM组8 kHz ABR 4 wk平均阈移达50 dB，GM+LAP组平均阈移为30 dB，差异显著(P<0.05). 形态学改变与听力变化一致. GM+LAP组血液中丙二醛较GM组明显减少(P<0.05). GM+LAP组超氧化物歧化酶活性明显高于GM组(P<0.05). LAP对庆大霉素血药浓度没有影响. 结论： LAP能有效减轻GM的耳毒性作用，水杨酸盐连接有其他基团并不影响拮抗耳毒性的作用. 并且更加安全,有效,方便临床使用.
【关键词】 庆大霉素/毒性；来比林；药物相互作用
0引言
庆大霉素（GM）早期在临床上应用较为普遍 ，其耳毒性所致的感音神经性聋较为常见. 近年有研究报道部分自由基清除剂和铁螯合剂可以减轻氨基糖甙类抗生素的耳毒性［1,2］. 已有实验证实水杨酸钠作为一种自由基清除剂对庆大霉素耳毒性有作用［3,4］. 药物来比林是乙酰水杨酸与赖氨酸的复盐，水溶性好，酸度适宜，可作注射用，避免对胃肠道的刺激，并具有更为强力的解热镇痛作用. 我们旨在利用听性脑干反应（ABR）、耳蜗铺片及透射电镜技术观察用LAP前后听阈及耳蜗毛细胞形态变化，测定血清中丙二醛（MDA）超氧化物歧化酶（SOD）含量，测定肾功和血清GM浓度，观察来比林（LAP）预防庆大霉素耳毒性的作用.
1和方法
1.1材料耳廓反射正常的健康雄性杂色豚鼠，体质量250~350 g, 由第四军医大学实验动物中心提供. 硫酸庆大霉素（西安高科陕西金方药业公司，批号 020207）,来比林（安徽新力药业股份有限公司蚌埠涂山分厂， 批号020713）.
1.2方法
1.2.1动物分组及处理48只豚鼠随机分为4组，每组12只. 正常对照组，不做任何处理；GM组： GM 120 mg・kg-1 皮下注射，1次・d-1，连续19 d；LAP组： LAP 120 mg・kg-1 皮下注射，2次・d-1，间隔5 h，连续19 d；GM+LAP组：第1次LAP和GM同时注射,5 h后，第2次注射LAP，剂量同上；动物实验期间每日秤体质量调整用药量. 用药前及用药后9 d, 19 d, 4 wk, 6 wk检测ABR，第4次测ABR后每组取2只豚鼠断头活杀. 一耳供透射电镜标本的制备，另一耳供光镜观察耳蜗铺片.
1.2.2ABR反应阈检测豚鼠的ABR 以Ⅲ波最著，动物在戊巴比妥钠40 mg・kg-1腹腔注射麻醉后，针型记录电极置前额正中皮下，参考电极置测试耳外耳道口后上皮下，鼻尖接地. 用 Biologic声刺激器，286自动采样，采用短纯音（tone burst，上升下降时间各2 ms，平台时间1 ms）1 kHz，8 kHz刺激，间隔75 ms，扫描时间20 ms，叠加256次，带通滤波80~1500 Hz,在屏蔽隔声室内常规测试.
1.2.3耳蜗硬铺片标本制备［5］动物断头活杀，取出听泡，于显微镜下在冰盒内快速摘除镫骨，刺破圆窗，挑开蜗顶；用5~10 g・L-1 AgNO3灌流浸泡15 min；0.1 mol・L-1的磷酸缓冲液（pH=7.4）漂洗；25 mL・L-1戊二醛固定2 h，爆光40~60 min，再置于25 mL・L-1戊二醛固定24 h（置4度冰箱），解剖显微镜下常规制备，分离各圈基底膜，甘油封片.
1.2.4透射电镜标本制备动物快速断头活杀，取出并打开听泡，用25 mL・L-1戊二醛磷酸缓冲液固定，另一只耳按常规方法制作透射电镜标本.
1.2.5管碟法测定庆大霉素血药浓度GM组和GM+LAP组动物第9日和第19日注射庆大霉素后1 h心肌取血，测定血清抑菌环直径，再查标准曲线图，得出血清庆大霉素浓度.
1.2.6检测血清中MDA,SOD用药后9 d和19 d各组动物心肌取血. 离心，取血清-20℃冻存. 采用南京建成生物工程研究所的丙二醛、超氧化物歧化酶试剂盒，按说明操作检测.
1.2.7检测肾功GM组和GM+LAP组动物3 wk注射庆大霉素后心肌取血，1000 r・min-1 离心10 min，取血清冻存，全自动生化分析仪（岛津CL8000,日本）测定血清尿素氮和肌苷.
学处理：运用统计学软件SPSS 10.0 进行组间t，P＜0.05为有显著性差异.
2结果
实验中GM组3只动物死亡，死前均消瘦、耳廓反射消失、无力. GM+LAP组有一只动物死亡. LAP组及对照组中无死亡.
2.1ABR用药后各组动物ABR出现阈移(Fig 1, 2). 豚鼠用药4 wk后平均反应阈变化率达最高阈移, 1 kHz ABR GM组（28.8±2.9）dB比GM+LAP组(42.5±3.7) dB听力损失大(P<0.05). 8 kHz ABR GM组(14.5±3.6) dB比GM+LAP组(16.8±3.7) dB听力损失大(P<0.05). 两组数据经方差分析差异显著(P<0.05)，高频听力损失比低频重. 对照组和LAP组的反应阈没有明显变化（P>0.05）.
aP＜0.05 vs GM＋LAP. GM: gentamicin; LAP: lysisin aspirin.
图1－图2 (略)
2.2形态学观察用药3 wk后耳蜗铺片显示GM组用药后外毛细胞损伤（Fig 3），从顶回至底回损伤逐渐加重，内毛细胞较外毛细胞损伤轻；GM+LAP组外毛细胞损伤较GM组轻（Fig 4）；透射电镜见GM组严重损伤，缺失的外毛细胞由支持细胞代替（Fig 5）. GM+LAP组病变较轻，主要为毛细胞胞质稀疏，线粒体变形空化等（Fig 6）.
图3－图6 (略)
2.3血清的MDA浓度和SOD活性GM组的MDA浓度高于GM+LAP组，组间差异非常显著(P<0.01, Tab 1); 在这两组中19 d时的均高于9 d时，两组间差异显著（P<0.05, Tab 1）; GM组SOD的活性低于GM+LAP组，组间差异非常显著(P<0.01, Tab 1); 在两组中19 d时的SOD活性，均高于9 d时，差异显著(P<0.05, Tab 1). GM组和GM+LAP组的MDA含量和SOD活性，均高于LAP组和Blank组(P<0.01 Tab 1).
表1不同用药时间的血清MDA, SOD含量 (略)
2.4血尿素氮(BUN), 血清GM含量和Cr检测GM组和GM+LAP组3 wk BUN和Cr的检测结果，两组间差异显著（P<0.01, Tab 2）. 两组间血清GM含量无明显差别(P>0.05, Tab 2).
表2不同组间的BUN, GM和Cr检测结果 (略)
3讨论
氨基糖甙类抗生素的耳毒作用机制之一为自由基学说［ 6-8］. 正常机体组织内有少量的自由基存在，病理状况下，自由基含量会增加，其中以氧族羟基自由基为主，直接造成细胞各成分损害，引起其代谢和功能障碍. 有研究发现水杨酸类物可作为自由基清除剂，具有自由基拮抗剂的作用. 国内也已有相关的实验证实水杨酸钠可以庆大霉素的耳毒性. 水杨酸盐在体内解离出水杨酸，水杨酸遇氧自由基可氧化生成二羟基苯甲酸，二羟基苯甲酸已被证实为有效的耳毒性拮抗剂. 但是水杨酸钠的副作用较大,对胃肠有刺激，临床使用中无针剂. 本实验中所用来比林是阿司匹林与赖氨酸的复盐（注射用赖氨匹林）已被证实具有以下特点：水溶性好，酸度适宜，可作注射用，避免了对胃肠道的刺激，并具有更为强力的解热镇痛作用； 血药浓度高，作用强度为阿司匹林的4~5倍； 不良反应少，可以与庆大霉素配伍使用，含有适量甘氨酸，增强了赖氨匹林的稳定性，大大减少了对注射部位的刺激性. 临床用药比水杨酸钠更为安全、有效、方便. 在本实验中GM+LAP组的ABR听阈明显低于GM组，说明来比林也是预防耳毒性的有效药物. GM所致ABR阈值升高模型高频损伤比低频损伤严重，形态学变化3 wk时显示GM+LAP组的损害比GM组损害轻. GM+LAP组主要为细胞胞质稀疏，有空泡，线粒体变形空化，溶酶体、多泡体增多. 这与以往文献报道的结果基本相符. 实验中庆大霉素的用量远远高于正常用量，而来比林的用量相当于正常的临床用药量，可见，来比林可在安全范围内有效预防庆大霉素的耳毒性.
【参考文献】
［1］ Song BB, Schacht J. Variable efficacy of radical scavengers and iron chelators to attenuate gentamicin ototoxicity in guinea pig in vivo［J］. Hear Res, 1996;94(12):87-93.
［2］ Song BB, Anderson DJ, Schacht J. Protection from gentamicin ototoxicity by iron chelators in guinea pig in vivo［J］. J Pharmacol Exp Ther, 1997;282(1):369-377.
［3］ Wang JL, Huang WG, Cheng Y, Liu SL. Sodium salicylate protects against gentamicin ototoxicity ［J］. Disi Junyi Daxue Xuebao (J Fourth Mil Med Univ), 2001;22（22）:2079-2082.
［4］ Wang JL, Huang WG, Cheng Y, Liu SL, Cha DJ. Sodium salicylate protects against gentamicin ototoxicity ［J］. Zhonghua Erbiyanhouke Zazhi (Chin J Otorhinolaryngl), 2000;35：66.
［5］ Liu SL, Wang JL. An experience of surface preparation of sliverimpregnated specimen ［J］. Disi Junyi Daxue Xuebao (J Fourth Mil Med Univ), 1985;6(4):353-354.
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［7］ Hirose K, Hockenbery DM, Rubel EW. Reactive oxygen species in chick hair cells after gentamicin exposure in vitro ［J］. Hear Res, 1997;104(12):1-14.
［8］ Clerici WJ, Hensley K, DiMartino DL, Butterfield DA. Direct detection ototoxiciantinduced reactive oxygen species generation in cochlear explants ［J］. Hear Res, 1996;98(12):116-124.
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