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益痛清对膜性肾病模型的治疗及其机制研究
膜性肾病（MN，membranous nephropathy）是以致密物在肾小球毛细血管壁上皮下沉积为特征的原位免疫复合物肾炎。近年来大量实践征明，对MN的治病有较好的疗效，尤其在缓解蛋白尿方面。益肾清配方是以黄芪、小蓟、川芎、海风藤及车前子五种组成，具有补气升阳、清热化瘀、凉血止血、利水清浊的功能，可减轻或缓解MN的蛋白尿、保护肾功能、修复肾小球结构的病理损伤。1
1.1 药品和拭剂
益肾清，棕红色粉末，1g粉末相当于13.75g生药，北京制药四厂提供。小牛血清白蛋白，帝道生物；大肠杆菌内毒素，北京邦定；生化试剂盒，北京中生。
1.2 动物
雄性新西兰家兔，1.5-2.0kg，中国药品生物制品检定所提供。BALB/C小鼠和C57BL/6J小鼠，18-22g，雌雄各半，雄性Wistar大鼠，150-200g均由北京大学区学部实验动物科学部提供。
1.3 仪器
ZS-1A型半自动生化分析仪，北京中生；TJ-6离心机和LSl701液闪仪，Beckman；VIS-7220型可见分光光度计，北京瑞利。
2 方法
2.1 益肾情治疗阳离子化牛血清白蛋白（C-BSA）诱导的家免MN。
2.1.1 模型制作
参考Boder1982年所用的方法制备C-BSA并制作模型。42只家兔测定各项血尿生化指标后，随机选出8只作为正常组，其余动物全部制作模型。首先每只动物iv C-０BSAlmg及大肠杆菌内毒素1μg，一周后开始每天iv C-BSA 10mg，4-7周时剂量加倍。待模型成功后除选两只模型动物送病理检查外，其余随机分为模型组、益肾清10g、5g、2.5g生药/kg体重剂量组．并给药治疗。
2.1.2 观察项目
每周动物称重一次。分别于实验前、造模成功、药物治疗4周和8周时测定血尿生化指标。动物杀检，作肾脏病理组织学检查。
2.2 益肾清对正常小鼠免疫功能的影晌
2.2.1 非特异性免疫——碳粒廓清法
将40只BALB/C小鼠随机分成益肾清28g、14g、7g生药/kg体重剂量组和溶剂对照组（0.25%CMC溶液）。连续给药20天后，小鼠iv印度墨汁0.05ml/10g体重，于1min和5min时分别取血20μl，加到2ml0.1%的碳酸钠溶液中摇匀比色(680nm)测光密度。 计算廓清指数K和吞噬指数α。
2.2.2 体液免疫——血清溶血素的分光光度测定法
将40只C57BL/6J小鼠分组给药同非特异性免疫。连续给药20天后，小鼠ip20%SRBC0.2，免疫后第4天取血，离心得血清，稀释500倍作溶血反应，比色（540nm）。计算样品半数溶血值HC50。
2.2.3 细胞免疫——淋巴细胞转化实验（3H-TdR掺人法）
将40只C57BL/6J小鼠分组给药同非特异性免疫。连续给药20天后，制备小鼠脾细胞悬液，加入培养板，同时加入ConA或LPS，5%CO2培养72小时。终止培养前6小时，加人3H-TdR（终浓度为2μci/ml）。收集细胞，测定样品放射强度。计算ConA和LPS诱导细胞转化率。
2.3 益肾清对大鼠的利尿作用
将40只雄性健康Wistar大鼠食18h后，随机分成益肾清20g、10g、5g生药/kg体重剂量组和溶剂对照组（生理盐水），给药5ml/100g体重。给药后半小时压大鼠下腹部排尽余尿，分别放人代谢笼中，收集给药后1、2、3、4、5小时的尿量。
2.4 益肾清对大鼠血液流流变学的影晌
将40只雄性健康WiStar大鼠随机分成益肾清20g、10g生药/体重剂量组、模型组（生理盐水）和溶剂对照组（生理盐水），给药7天。最后一天除溶剂对照组外，其余四组动物sc Adr0.2ml，共2次，两次间隔6h，间隔中间将功物放入冰水浴中5min给予冷刺激，造成血瘀模型。末次注射Adr18h后，腹主动脉取血，肝素抗凝，B转子剪切速率由高到为307.20s-1、153.60s-1、61.44s-1、30.72s-1、15.36s-1，不同切变率下测全血表观粘度（ηb）；分离血浆，307.20s-1下测血浆粘度（ηp）。
2.5 学处理组间比较用t。
3 结果
3.1 益肾清对C-BSA诱导的家兔MN的治疗作用
3.1.1 一般情况
模型组动物于造模后不同程度的摄食减少、精神不振、体重减轻、水肿、少尿等现象。给药后治疗组动物水肿逐渐消失，模型组也有自愈趋势。治疗组动物体重高于模型组，但仍低于正常组，各组没有显著性差异。
3.1.2 血尿生化指标
造模第3周模型组有动物出现蛋白尿，至造模第7周所有模型组动物均出现蛋白尿，TP24、BUN、CHO比正常组显著升高（P<0.01），ALB明显降低(P<0.05)，TRIG也明显升高(P<0.05)说明模型己经形成。药物治疗4周时，仅益肾清10g生药/kg体重剂量组的TP24比模型组明显降低(P<0.05)，其余各组各指标均无明显交化。治疗8周时，治疗组的TP24、BUN、TRIG及CHO均比模型组明显降低（P<０.01或P<0.05），ALB明显回升（P<0.05），基本恢复至正常水平。
3.1.3 肾脏病理组织学检查
3.1.3.1 肉眼观察
实验结束时，动物杀检，发现正常组的肾脏和脾脏外观表面光滑，色泽正常。益肾清各治疗组的外观色泽及大小无明显变化。而模型组的肾脏两端钝圆，中间略隆起，表面不甚光滑，个别肾及脾脏明显增大，肾脏、脾脏的脏器系数均比正常组明显增大(P<0.05)。
3.1.3.2 病理改变
正常组免疫荧光检查阴性，光镜和电镜检查未见异常。模型组IgG、C3沿肾小球毛细血管壁高强度颗粒状沉积，C3沉积较弱。光镜检查可见GBM增厚，系膜增生并有少量粒细胞浸润，电镜检查可见GBM弥漫增厚，上皮下多数电子致密物沉积，上皮细胞足突融合。益肾清各治疗组的免疫荧光检查与模型组相比无差异。10g、5g生药/kg体重剂量组的光镜和电镜检查已基本恢夏正常，2.5g生药/体重剂量的的光镜检查已恢复正常，但电镜检查仍有GBM轻度增厚和节段性上皮细胞足突融合现象。
3.2 益肾清对正常小鼠免疫功能的影响
益肾清28g、14g生药/kg体重剂量组，小鼠的α、HC50及ConA和LPS诱导细胞转化的能力比溶剂对照组明显增强（P＜0.05或P＜0.01）。各剂量组之间有明显的量效关系。
3.3 益肾清对大鼠的利尿作用
益肾清20g、10g生药/kg体重剂量组，大鼠1小时尿量及5小时内总尿量与溶剂对照组相比都有显著增加（P<0.01），提示其有较强的利尿作用。
3.4 益肾清对大鼠血液流变学的影响
血瘀模型组动物的μb值和μp值皆显著高于溶剂对照相（P＜0.01），标志模型的形成；益肾清20g、10g生药/kg体重剂量组，大鼠的ηb值和ηp值比模型组均显著降低（P＜0.01，P＜0.05）。说明益肾清能降低血瘀大鼠全血的高、低切变粘度及血浆粘度，提示其有活血化瘀的作用。
4 讨论
自1982年以来，Boder等用C-BSA成功诱导了家兔MN之后，阳离子抗原已被广泛地应用于肾炎的实验研究。该模型与人类MN颇为相似，具有一定的代表性。它发病率高，重复投好，病理改交一致，适合肾炎发病机理及防治的研究。
本实验成功地复制了C-BSA诱导的家免MN模型。比较正常组，模型组动物TP24和BUN明显升高，ALB显著降低，TRIG和CHO也显著增加，这些指标的变化与文献报导一致。依据MN的病理改变可分四期。本突破的模型组IgG、C3沿肾小球毛细血管壁高强度颗粒状沉积。光镜检查可见GBM增厚，系膜增生并有少量粒细胞浸润，电镜检查可见GBM弥漫增厚，上皮下多数电子致密物沉积．上皮细胞足突融合。此症状与MNⅢ期病理症状相符，说明此实验模型复制成功。
益肾清的主要成分有：黄芪、小蓟、川芎、海风藤及车前子。黄芪主补气升阳，利水退肿。小蓟主清热解毒，凉血止血，清下焦热结，可控制炎症反应。川芎与海风藤协同作用，活血行气，祛湿通络，可改善毛细血管循环。车前子主利水，分清浊，可发挥疏通尿路作用。为了更深一步的研究，我们观察了益肾清对大鼠的尿量、血液流变学及正常小鼠免疫功能的影响，发现该药具有较强的增强免疫、利尿和活血化瘀功能。说明益肾清对MN的治疗可能是通过利尿、活血化瘀或免疫增强作用等多种机制发挥作用的，但确切机制还需进一步验证。
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