滨州市部分地面水体细菌耐药性分析

滨州市部分地面水体细菌耐药性分析

　　【摘要】 目的 为了了解滨州市内地面水体中细菌的耐药性，并探讨其与耐药质粒谱之间的关系。方法 采集滨州市内4个地面水体的水样，分别检测水样菌落形成单位(colonyforming unit，CFU)以及氨苄青霉素耐药率，用KB法对氨苄青霉素耐药菌株分别做7种不同抗生素的药敏试验，然后提取这些菌株的质粒，用EcorI酶切质粒电泳后分析酶切质粒谱。结果 样本氨苄青霉素耐药率达11?7%~49?8%。氨苄青霉素耐药菌株对其他3种不同的抗生素分别有12?5%~25%不等的耐药性，未找到耐西拉司丁钠的菌株。耐氨苄青霉素以及一种非β内酰胺类抗生素的菌株占32?5%，耐氨苄青霉素以及两种或者以上的非β内酰胺类抗生素的菌株占20%。酶切质粒谱共找到从815 bp~12?2 kb的63种大小不等的酶切片断。结论 滨州市地面水体中细菌耐药性普遍存在，且多重耐药性明显;对细菌耐药性的监测是十分有意义而且有必要的。

　　【关键词】 地面水体;细菌耐药性;质粒谱

　　【Abstract】 Objective To survey the condition of antibiotic resistance in ground water body of Binzhou, and to study its relationship with plasmid profiles.Methods Water samples were collected from 4 places of ground water body of Binzhou, then CFU was counted and the antibiotic resistance rate was analyzed. KB method was used to practice the susceptibility test with 5 antibiotics, then the antibiotic resistance spectrums were analyzed.Results The ampicillin resistance rate of the samples varies from 11?7% to 49?8%. The ampicillin resistant isolates have different antibiotic resistance rate which varies from 12?5% to 25% relevant to 3 other antibiotics，and the cilastain resistance was not found . Isolates with the trait of ampicillin resistance and one nonβlactam antibiotic reached 32?5%, and isolates with the trait of resistant to ampcillin and two or more nonβlactam antibiotics reached 20%. There are 63 plasmids bands which varys from 815bp to 12?2kb in plasmid profiles.Conclusion The antibiotic resistance in ground water body of Binzhou was prevalent, and the phenomenon of multidrug resistance is obvious too. It is significant and necessary to monitor the antibiotic resistance status .

　　【Key words】 ground water body, drug resistance of bacteria, multidrug resistance

　　在自然界中，细菌的耐药性是普遍存在的。随着现代医学中抗生素的大量使用，在自然选择压力下，细菌的耐药性也越来越强，再加上耐药基因的传代、转移、扩散，耐药菌越来越多，耐药程度不断增加，形成高度和多重耐药。大量研究表明质粒的水平转移在细菌多重耐药性的形成中起了重要作用[1]。通过这种水平转移，细菌的耐药性扩散迅速、广泛，耐药株可自身克隆扩散，也可与敏感株进行遗传物质交换。这种现象在自然水体中广泛地存在，这使多重耐药性成为一个世界范围内的问题，造成和加剧了对新的抗菌药物的需求。本课题的研究目的就是要了解滨州市部分地面水体中细菌耐药性的特点，并分析该地区细菌耐药性与细菌质粒谱的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂 常规LuriaBertani(LB)培养基。Mueller Hinton(MH)琼脂培养基、药敏纸片、0.5麦氏比浊管等购自杭州天和微生物试剂有限公司。质控菌株大肠杆菌ATCC25922由浙江大学附属第一医院检验科细菌室提供。

　　1.2 主要仪器 普通超净工作台，柯达电子成像和分析系统120(柯达公司)，Gelpro Analyzer 4?0(Media Cybernetic公司)。

　　1.3 方法

　　1.3.1 采集水样：用灭菌的吸量管采集水样。每个水体中采5个水样，每个水样采集点之间的距离超过100 m，每个水样采集10 ml，并记录水温。

　　1.3.2 检测水样菌落形成单位(CFU)以及氨苄青霉素耐药率： 稀释水样至1∶10和1∶100,将稀释的水样分别培养到LB琼脂和氨苄青霉素(终浓度60 μg/ml)+LB琼脂培养基中(每个培养皿中0?1 ml的稀释后水样)，然后在37 ℃的恒温箱中培养24 h。培养后分别计数每个培养皿中的菌落数目(采用柯达电子成像和分析系统120摄像后用Gelpro Analyzer 4?0自动计数)。

　　1.3.3 KB法药敏实验：将耐氨苄青霉素组的菌株进行纯培养(37 ℃，氨苄青霉素+LB琼脂培养基中24 h)，之后从每个培养皿中挑取两个远离的菌落各自放入盛有3 ml 氨苄青霉素+MH肉汤的试管中，在37 ℃的摇床中摇约3 h。从每个试管中取1 ml菌液，用生理盐水稀释至0?5 MacFarland标准浊度;另外的2 ml菌液继续在37 ℃摇床中培养过夜。用棉签将稀释的菌液涂布在MH琼脂培养基上，美国NCCLS药敏实验纸片扩散法[2]对每个菌株进行药敏实验。实验采用的抗生素有氨苄青霉素、链霉素、氯霉素、左氧氟沙星、西拉司丁钠。

　　1.3.4 酶切质粒谱分析：将过夜培养的菌株用碱裂法制备少量质粒DNA[3]，将质粒用EcorI酶切后在0.7%凝胶琼脂糖平板上加样电泳[4]，以1 kb Gene Ladder作为标准，10 V/cm稳压电泳1 h，在柯达凝胶成像系统中摄影后，获取照片后使用Gelpro Analyzer 4?0 分析。

　　2 结果

　　2.1 水样CFU以及氨苄青霉素耐药率 从4个水体中采集到的20个水样中细菌CFU和氨苄青霉素耐药率见表1，从表中我们可以看到4个水体中的细菌CFU已经较高，而且细菌对氨苄青霉素的耐药率也相当高。

　　表1 水体中细菌CFU和氨苄青霉素耐药率水体nalogCFU/mlb氨苄青霉素耐药率(略)

　　2.2 药敏试验 通过纸片法药敏实验得到的氨苄青霉素耐药菌株对其它抗生素的耐药谱见表2。从表2中我们看到不同细菌对多种抗生素具有耐药性，而未发现作为碳青霉烯类的西拉司丁钠有耐药菌株。

　　表2 氨苄青霉素耐药菌株对其它抗生素的耐药性水体测试　略

　　2.3 酶切质粒谱 我们把提取的15个质粒样本经EcorI酶切电泳后得到14个条带，质粒检出率为93?3%。由于采用了1 kb Gene Ladder作为标准，经过EcorI酶切电泳得到的胶带摄片后经过Gelpro Analyzer 4?0分析，找到815 bp~12?2 kb的63种大小不等的酶切片断，质粒最少具有3个酶切片断，最多具有10个酶切片断。其中13个质粒具有12?2 kb片断，10个质粒具有12?1 kb酶切片断，9个质粒具有10?5 kb酶切片断，4个质粒含有8?9 kb酶切片断。

　　3 讨论

　　从我们所调查的4个水体来看，除中海外,滨州市地面水体中细菌含量偏高，而且细菌存在对氨苄青霉素等常用抗生素的广泛耐药，这个与国内普遍存在的医疗单位和养殖业滥用抗生素现象不无关系[5]。国内外很多资料显示在河流[6]、下水道[7]、屠宰场[8]和鱼[9]、家禽等体内普遍存在耐药性细菌。耐药性产生的直接后果是严重影响了临床疗效，增加了治疗成本，同时缩短新药的应用周期，增大了新药的研究与开发成本，尤其在人畜同药的情况下，耐药性通过畜产品以及环境等途径引起的交叉传播，直接对人体健康构成威胁。因而，细菌耐药性问题已经引起了人们的广泛关注。从目前的研究来看，细菌对抗生素产生耐药性的机制主要有以下几个方面[10]：①产生灭活酶或钝化酶，使抗生素在达到作用部位前即被破坏或失活。②细菌改变细胞壁的成分和结构，使细胞膜的通透性发生变化，使抗生素无法进入细胞内到达作用部位而不能发挥抗菌效能。③改变靶位,使不易为抗生素所作用。如细菌改变青霉素结合蛋白的结构或产生新的青霉素结合蛋白减少与 β内酰胺类抗生素的亲合力而耐药。④细菌还可通过提高生物合成抗生素拮抗物的量而耐药。细菌的耐药基因可以通过染色体介导，更重要的是可以通过质粒介导。

　　耐药质粒通过转化转导、接合、易位或转座等方式在微生物间转移造成耐药因子增多，从而不但可以在同种间传播，而且可以在不同种及非致病菌间传播，造成院内和院外感染流行，大大增加细菌耐药问题的严重性。在实验中我们也发现很多细菌具有多重耐药性，即一种细菌具有对多种不同类型的抗生素具有耐药性。关于产生多重耐药性的机制，过去一般认为细菌产生耐药性与抗菌药的结构和作用机制有关,并通过质粒携带的耐药基因扩散耐药性，同类结构药物或作用机制相似的药物具有部分或全部交叉耐药性。然而,近几年随着分子生物学手段的不断应用，人们开始从三个层面来认识细菌的耐药性，上述的细菌耐药机制可作为第一层面;第二层面则是由于细菌长期接触药物，引起菌体细胞膜孔蛋白的丢失，从而导致细胞膜通透性下降，引起低度耐药;而第三层面则是细菌细胞膜上的外排泵(主动外排系统)的表达水平不断提高，能主动将扩散入细菌细胞内的药物或其它底物泵出细胞外，从而使细菌获得耐药性。细菌细胞膜的通透性下降仅能引起低度耐药性,细菌形成多重耐药性主要与细菌中存在的外排泵有关[10]。二者所产生的协同作用使细菌产生了对多种抗菌药的高度耐药性即高水平的多重耐药性。从酶切质粒谱结果来看，我们发现在耐氨苄青霉素菌株中12.2 kb的酶切片断和12.1 kb的酶切片断大量存在，这些片断可能与细菌耐氨苄青霉素的特性存在一定联系，而更明确的耐药谱与质粒谱之间的关系，尚需进一步研究。本实验结果是具有局限性的[11]，它仅仅代表一部分可以在有氧环境和特定培养基中生长的细菌，那些未被培养出来的细菌同样可能具有一定的耐药性，而且其也可能作为耐药基因的载体而传播细菌的耐药性。

　　【参考文献】

　　[1]　 Thomas DJ, Morgan JA, Whipps JM ，et al. Plasmid transfer between bacillus thuringiensis subsp israelensis strains in laboratory culture, river water, and dipteran larvae[J].Appl and Environ Microbiol，2001,67 (1):330338.

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　　[4]　魏旭兰，罗明，潘若男. 细菌质粒电泳分析技术及其注意事项[J].江西医学检验，1999，17(4)：230 231.

　　[5]　李爱华.水产养殖中使用的抗菌药物及细菌耐药性[J].中国水产科学，2002,9 (1):8791.

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　　[11]　朱华庆，王雪，张素梅,等.限制性内切酶酶切及限制性内切酶酶切图谱分析[J]. 安徽大学学报，2003,4:3842.

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