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大黄对慢性肾功能不全大鼠保护机制的研究
【摘 要】 目的 观察大黄对慢性肾功能不全大鼠肾功能及肾组织TGF-β1和smad7表达的影响。方法 采用腺嘌呤法建立大鼠慢性肾功能不全模型，治疗组予以大黄(4 g/kg/d)灌胃。治疗4 周后，检测各组大鼠的24 小时尿蛋白定量、肾功能，通过组织学及蛋白印记观察肾组织TGF-β1和smad7的表达。结果 治疗组大鼠的24h尿蛋白定量、肾功能明显增加(P<0.01)，而治疗组大鼠24 h尿蛋白定量、肾功能较非治疗组减少(P<0.05)。非治疗组大鼠肾组织TGF-β1、smad7表达较正常组明显增加(P<0.01)。结论 大黄可降低慢性肾功能不全大鼠24 小时尿蛋白、肾功能水平，抑制肾组织TGF-β1和smad7表达。大黄对慢性肾功能不全的保护机制可能与降低肾脏TGF-β1和smad7表达有关。
【关键词】 大黄;慢性肾功能不全;腺嘌呤;转化生长因子-β1;smad
[Abstract] Objective To study the effect of Dai Huang on glomerulosclerosis and expression of TGF-β1 and smad7 in rats with CRF. Methods Rats were divided into control group, not treated group and Dai Huang treated group with 20 rats in each group. The rats in the latter two groups were intragastric of Adenine. the treated group was fed with Dai Huang at a dose of 4g/(kg·d) for 4 weeks. Urine protein excretion, urea nitrogen and creatinine was measured. The expression of TGF-β1 and Smad7was measured. Results Compared with the control group, the not treated group showed higher urine protein excretion, urea nitrogen, creatinine(P<0.01)and expression of TGF-β1 and smad7. Conclusion Dai Huang can diminish urine protein excretion and prevent glomerulosclerosis in subtotally nephrectomized rats. This protective effect is presumed to be associated with its effect on expression of TGF-β1 and Smad7.
[Keywords] Dai Huang; Chronic renal failure; Adenine; TGF-β1; Smad7
大黄为蓼科植物掌叶大黄，现代药理学研究发现，大黄有抗血小板聚集、降血脂、清除氧自由基、提升超氧化物歧化酶(SOD)的活性，减轻免疫炎症反应的功效，同事具有泻热通便、解毒消痈、行瘀通经功效。我们通过观察大黄对慢性肾功能不全大鼠的治疗，观察其对尿蛋白排泄、肾功能的影响;并观察其对肾组织中转化生长因子β1(TGF-β1)、smad7的蛋白表达及肾脏病理变化的影响，探讨大黄对慢性肾功能不全的疗效及作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料
湖北产中药材大黄。腺嘌呤(产品批号2007109)。兔抗TGF-β1、Smad7抗体;En Vision免疫组化试剂盒;BCA试剂盒。
1.2 实验动物分组和模型建立
雄性SD大鼠60 只，7 周龄，体重190±20 g。适应性饲养1 周，随机分为正常组20 只和腺嘌呤组40只。腺嘌呤组每日腺嘌呤300 mg/kg灌胃，6 周后以代谢笼留取24 小时尿液，眶内静脉采血，测定24 小时尿蛋白定量、血尿素氮、血肌酐。检测发现全部造模成功。随机分为2 组：非治疗组20 只，治疗组20 只。治疗组大鼠每日给予黄葵胶囊[2 g/kg·d]灌胃，同时正常组和非治疗组给予等量生理盐水灌胃。4周后全部大鼠以代谢笼留取24 小时尿液，眶内静脉采血，测定24 小时尿蛋白定量、血尿素氮及肌酐。大鼠处死后取部分肾组织置于10%中性甲醛中固定，部分肾组织液氮保存用于蛋白印迹杂交方法(Western blot)检测蛋白表达。实验期间大鼠自由饮水、进食。
1.3 检测方法
1.3.1 尿蛋白定量及肾功能测定
1.3.2 病理形态学观察
肾组织经10%中性甲醛固定，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸腊、包埋、切片，厚3 µm，行HE染色，观察肾小球硬化及肾间质纤维化的程度。
1.3.3 蛋白印记分析
各组取约100 mg肾组织置于1 ml裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂PMSF 100ug/ul，aprotinin 1 ug/ml，leupeptin 1 ug/ml)，匀浆后冰浴30 分钟，然后4 度12000 g离心20 分钟。提取蛋白后用BCA法测量蛋白浓度。取等量蛋白质进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干法转移至聚氟乙烯膜上，封闭液封闭，加入1：200稀释的 TGF-β1抗体，4 ℃过夜。0.05%TBST洗膜3 次，ECL显影。
1.4 统计学处理
计量资料采用均数±标准差表示，数据用SPSS 13.0软件包进行统计学处理。各组间均数比较采用单因素方差分析，P <0.05认为有统计学意义(方差齐时用LSD法、方差不齐时用Tamhane法)。
2 结果
2.1 尿蛋白定量变化
非治疗组和治疗组大鼠尿蛋白排泄明显高于正常组(P <0.01);治疗组大鼠尿蛋白定量与非治疗组比较有所降低(P <0.05)，见表1。
2.2 血清生化指标变化
非治疗组和治疗组大鼠血肌酐明显高于正常组(P <0.01);治疗组大鼠血肌酐与非治疗组比较有所降低(P <0.05);尿素氮变化同血肌酐变化，见表1。
表1 各组大鼠尿蛋白定量、血尿素氮、肌酐水平( )
组别 n 尿蛋白定量(mg/d) 尿素氮(mmol/L) 肌酐(µmol/L)
正常组 20 9.24±2.16 7.26±1.03 48.26±9.36
非治疗组 20 169.36±27.69* 18.57±3.89* 119.41±15.86*
治疗组 20 89.1±17.34*▲ 14.18±5.34*▲ 80.64±12.25*▲
*与正常组相比，P<0.01，▲与非治疗组相比，P<0.05。
2.3 组织病理学改变
在HE染色中，非治疗组大鼠可见明显的肾小球增生，系膜增殖，肾小球毛细血管部分塌陷，球囊粘连，部分肾小球完全硬化，间质有炎细胞浸润，部分肾小管已萎缩，系膜外基质显著增加(图1)。治疗组与非治疗组比较，肾小球损伤、硬化轻，肾间质炎细胞浸润少，间质纤维化。
2.4 肾组织TGF-β1和smad7用蛋白印记方法检测结果
治疗组和非治疗组大鼠相比TGF-β1表达下调，而smad7表达上调。见图2。
3 讨论
慢性肾功能不全是所有肾脏疾病进展的共同结局，其实质是肾脏纤维化，严重威胁人类健康。目前研究表明，TGF-β1和其受体下游的信号转导因子Smad7蛋白在促进肾小球纤维化及肾小管间质纤维化方面起重要作用。
TGF-β1 是迄今已知作用最强的一种促肾纤维化的细胞因子，具有调节细胞的增殖、分泌、迁移和凋亡等多种生物学活性。TGF-β1在肾纤维化中的作用涉及到细胞外基 (ECM)、细胞增殖及转分化、炎症浸润等各个环节，是介导肾小球硬化和肾间质纤维化关键细胞因子，在肾纤维化过程中TGF-β1起着关键作用[2]。
正常组 非治疗组 治疗组
图2 Western blot检测各组大鼠TGF-β1和smad7蛋白表达结果
目前认为，Smad7主要通过与TGF-β1型受体结合抑制TGF-β1信号转导，以往在许多肾脏疾病如肾小球肾炎、肾病综合征、狼疮性肾炎、糖尿病肾病等的动物模型和人的肾活检标本的研究中，都提示TGFβ1/Smad7信号通路被激活，用抗TGF-β1的抗体或Smad7转基因治疗时，慢性肾脏病的肾脏纤维化得到改善，提示Smad7信号通路在肾脏纤维化的发生发展中起着重要作用[3]。
现代实验表明大黄能抑制TGF—β1的过度表达，减缓肾功能恶化速度，而被被广泛用于治疗慢性肾小球肾炎和慢性肾衰竭[4]。慢性肾功能不全的实质是肾脏纤维化，而TGF-β1是促肾纤维化最重要的细胞因子，smad7 蛋白是TGF-β1受体的胞内激酶底物，在调节TGF-β1促肾纤维化过程中起重要作用，本实验结果显示大黄可能通过减少腺嘌呤致慢性肾功能不全大鼠的 TGF-β1及增加smad7蛋白表达，来减缓甚至抑制肾小球及肾间质纤维化;降低大鼠24 小时尿蛋白定量、血尿素氮及血肌酐;减轻慢性肾功能不全大鼠肾病组织的病理改变，延缓慢性肾功不全进入终末期肾衰竭的时间。
参考文献
[1] Wang W, Koka V, Lan HY. Et al. Transforming growth factor-beta and Smad signalling in kidney diseases[J]. Nephmlogy(Carlton),2005,10(1):48-56.
P2] Keith H,Jeremiah M.OP-l prevents renal fibrogenesis associated with ureteral obstruction[J].Am J Phy Ren Phy. 2000,280(3):130-136.
[3] Hirotaka Fukasawa.Tatsuo Yamamoto. Treatment with anti-TGF-β1antibody ameliorates chronic progressive nephritis by inhibiting Smad/TGF-β1 signaling[J].Kidney International,2004,65:63-74.
[4] 张冉,许旭东. 大黄灌肠对慢性肾衰竭患者转化生长因子-β1及肾功能的影响[J].中国中西医结合肾病杂志,2008, 9(3):263-264.
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