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反相高效液相色谱法测定人血浆中艾司西酞普兰的浓度
【摘要】 目的 建立测定人血浆中艾司西酞普兰浓度的HPLC?FLD法。方法 以DiamonsilTM C18反相柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)为色谱柱，流动相为乙腈?0.03 mol·L-1醋酸铵(体积比45∶55，调pH=6.0)，流速为0.8 mL·min-1，激发波长：235 nm，发射波长307 nm，以正己烷?异戊醇(体积比95∶5)为提取剂。结果 艾司西酞普兰的高(25 μg·L-1)、中(10 μg·L-1)、低(1.5 μg·L-1)3个浓度的平均回收率分别为95.29%、97.01%和97.22%，日内(n=5)、日间(n=3)RSD均小于15%;分析方法的最低定量限为0.5 μg·L-1，线性范围为0.5～50 μg·L-1,回归方程为ρ=20.93A-0.015，r=0.999 9(n=7)。结论 该方法灵敏、准确、简单、快速，可用于临床血浓监测和药动学研究。
【关键词】 艾司西酞普兰;血药浓度;反相高效液相色谱法
Abstract:Objective To set up an RP?HPLC method for content determination of escitalopram in human plasma.Methods Escitalopram was extracted with hexane?isoamyl alcohol. The residues were analyzed on an RP?HPLC column (Diamonsil C18, 5 μm, 4.6 mm×250 mm) using a mobile phase consisting of acetonitrile?0.03 mol·L-1 NH4Ac (45∶55，pH6.0). The fluorimetric excitation and emission wavelength was 235 and 307 nm, respectively.Results The average recoveries of three concentrations of escitalopram(25,10, 1.5 μg·L-1) were 95.29%, 97.01% and 97.22%, respectively. Inter? (n=3) and intra?day(n=5) assay RSD were less than 15%. The calibration curve was linear over the range of 0.5-50 μg·L-1 ( r = 0.999 9, n=7)and the limit of quantitation for escitalopram was 0.5 μg·L-1. Conclusion The method is sensitive, accurate, precise and reliable for clinical monitoring of plasma escitalopram.
Key words:escitalopram;plasma concentration;RP?HPLC
艾司西酞普兰(escitalopram，ETP)是新一代的抗抑郁药物，其对5?羟色胺重吸收抑制剂的相对选择性在同类药物中最高，能有效抑制5?羟色胺的再摄取，具有很强的抗抑郁作用。目前该药由西安杨森制药股份有限公司首次在国内上市。其检测方法国外采用高效液相色谱法[1-2]和LC?MS检测法[3]。为便于进行血药浓度监测和药动学研究，本文参照文献[4]建立了以度洛西汀为内标的测定人血浆中艾司西酞普兰浓度的HPLC?FLD法。
1、仪器与试药
1.1仪器
Agilent1100 HPLC仪配荧光检测器G1321A，G1313A自动进样器，G1311A自动调配泵，G1316A可调柱温恒温箱，Agilent色谱化学工作站(美国惠普);旋涡混合器(原上海医科大学仪器厂);电子天平(瑞士SARTORIUS);MICRO12?24高速离心机(美国);MMM?GROUP真空干燥箱(德国)。
1.2药品和试剂
草酸艾司西酞普兰对照品(西安杨森制药有限公司，批号：050608，质量分数>99.5%)，内标物为度洛西汀(美国礼来公司，批号：050621，质量分数>99.8%)。乙腈(色谱纯，迪马公司)，水为超纯水，其余均为分析纯。
1.3对照品和内标溶液
精密称取草酸艾司西酞普兰适量(含艾司西酞普兰10.0 mg)加乙腈溶解并定容至10 mL，于冰箱4 ℃避光保存。临用时用乙腈?水(体积比50∶50)稀释成所需浓度的艾司西酞普兰对照品溶液。度洛西汀浓度为10 mg·L-1的乙腈溶液。
2、方法与结果
2.1色谱条件
DiamonsilTM C18反相柱为色谱柱(迪马公司，4.6 mm×250 mm, 5 μm)，流动相为乙腈?0.03 mol·L-1 醋酸铵(体积比46∶54)，用甲酸调pH=6.0)，流速0.8 mL·min-1，柱温30 ℃;激发波长：235 nm，发射波长307 nm。艾司西酞普兰和度洛西汀的保留时间分别为6.3 min和8.5 min。见图1。
图1艾司西酞普兰HPLC色谱图 略
2.2样品处理
取1 mL含药血浆加至10 mL锥形玻璃离心管中，加入10 mg·L-1的度洛西汀溶液50 μL，快速振荡5 s，加入0.1 mol·L-1的氢氧化钠溶液0.2 mL，振荡5 s。加入3 mL正己烷?异戊醇(体积比95∶5)密塞，旋转振荡30 s，3 000 r·min-1离心10 min，吸取有机层转入5 mL锥形玻璃离心管内，30 ℃真空干燥至干。进样前加入0.1 mL乙腈?水(体积比50∶50)溶解，快速振荡10 s溶解残渣，吸取10 μL进样。
2.3标准曲线的制备
取空白血浆1 mL 8份，分别加入0、10、20、50、100、200、500、1 000 μg·L-1浓度的艾司西酞普兰对照品溶液，振荡5 s，使血浆药品质量浓度相当于0、0.5、1、2.5、5、10、25、50 μg·L-1，然后按血样处理方法处理。经HPLC分析，测得ETP峰面积与内标峰面积之比(A)作横坐标，以血浆ETP质量浓度(ρ)为纵坐标，得到0.5.～50 μg·L-1范围的血浆ETP浓度标准曲线。直线方程为：ρ=20.93A-0.015，r=0.999 9。当RS/N=3时,最低检测浓度为0.5 μg·L-1。分别取5个不同来源空白血浆1 mL，分别加入10 μg·L-1的艾司西酞普兰乙腈溶液50 μL，按照“2.2”项操作，测得结果为(0.54±0.03) μg·L-1，RSD为4.75%。
2.4回收率及精密度试验
取高、中、低3种浓度(25、10、1.5 μg·L-1)制作提取前和提取后的2组样品，经色谱分析，以峰面积比较,得到的提取回收率均大于90%。按“2.3”项下方法分别配制高、中、低3种浓度样品，在1 d内和分散于2周内测定其浓度，计算日内、日间误差及相对回收率。结果见表1。
2.5血浆样品的稳定性试验
按“2.3”项下方法分别配制高、中、低3种浓度(25、10、1.5 μg·L-1)的3组血浆样品,分别在室温(放置6、12、24 h )、长期冻存(-20 ℃冻存1、2、3 星期)和冻融(1、2、3次)条件下分别进行色谱测定，结果见表2。
表1回收率与日内、日间精密度 略
表2稳定性考察 略
2.6质控样品的监控
按“2.3”项下方法分别配制高、中、低3种浓度(25、10、1.5 μg·L-1)置-20 ℃冻存，备用，此即为质控样品。每天检测血样品前须按照“2.3”项方法制作随行标准曲线及检测高、中、低3种浓度双份质控样品，如果相对回收率均在85%～115%(低浓度可在80%至120%之内)内时，即可认为仪器检测正常，否则须检查整个操作过程以及仪器原因。
2.7临床检测实例
40例抑郁症患者，男25例，女15例，年龄19～73岁，平均(23±11)岁，连续服药14 d血药浓度达稳态后测定艾司西酞普兰浓度，结果：15例口服5 mg·d-1，平均稳态血药浓度为(15.14±8.00) μg·L-1;22例口服10 mg·d-1，平均稳态血药浓度为(19.08±8.81) μg·L-1;3例口服15 mg·d-1，平均血药浓度为(62.08±23.74) μg·L-1。
3、讨 论
3.1测定波长的选择
在激发波长220～400 nm和吸收波长300～500 nm范围进行扫描，发现最大激发波长为235 nm，最大吸收波长为307 nm，与文献[4]报道的236 nm和306 nm相似。
3.2流动相的选择
曾试用乙腈?0.03 mol·L-1醋酸铵为流动相，按不同配比均发现艾司西酞普兰峰拖尾，峰形对称性不理想;用甲酸调pH值为6，乙腈?0.03 mol·L-1醋酸铵的体积比为45∶55时，峰形对称，半峰宽窄;设定流速为0.8 mL·min-1时，柱温为30 ℃时，出峰时间理想，检测时间比文献[4]的时间缩短5 min，故采用此色谱系统。
3.3提取溶剂的选择
分别曾试用乙醚、正己烷、醋酸乙酯、乙腈、氯仿和正己烷?异戊醇为提取剂，经过比较发现在正己烷?异戊醇(体积比95∶5)中的提取率最高，故采用此混合溶剂作为提取剂。
3.4 内标物的选择
经过对β?萘酚、盐酸普萘洛尔、替米沙坦、度洛西汀等物质或药物的比较发现，替米沙坦与艾司西酞普兰色谱峰分不开，β?萘酚和盐酸普萘洛尔相离太远，均不是理想的内标物，而度洛西汀与艾司西酞普兰提取条件相似，且色谱峰分得开，内源性物质不干扰，故选择度洛西汀为内标物。
本文方法操作简单、快速，检测结果准确、灵敏度高、重复性好，检测定量限为0.5 μg·L-1，低于文献[5]报道的1.3 μg·L-1，可作为临床常规艾司西酞普兰的血浓监测及其药动学研究的方法。
【参考文献】
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