高效液相色谱法测定复方养血生发片中二苯乙烯苷的含量
【摘要】 高效液相色谱法测定复方养血生发片中何首乌有效成分二苯乙烯苷(2,3,5,4′?四羟基二苯乙烯?2?O?β?D?葡萄糖苷)的含量。方法 流动相为乙腈?1%磷酸 (体积比15∶85);色谱柱为C18 柱;紫外检测波长为320 nm。结果 二苯乙烯苷在1.04～3.64 μg范围内具有良好的线性关系;平均回收率为99.36%，RSD为0.41%(n=9)。结论 该方法灵敏度、专属性高、重现性好，快速简便。
【关键词】 高效液相色谱法 二苯乙烯苷 复方养血生发片
Abstract:Objective To determinate the content of stilbene glycoside, an active ingredient of Polygonum multiflorum, in the compound Yangxueshengfa tablets by HPLC. Methods The mobile phase consisted of acetonitrile?1% phosphoric acid (15∶85). The column was C18 column. A UV?detector was employed and the detection wavelength was 320 nm. Results 2,3,5,4’?tetrahydroxystilbene?2?O?β?D?glucoside has a good linearity within the concentration range of 1.04-3.64 μg/mL. The average recovery was 99.36% (n=9, RSD=0.41%). Conclusion The method is rapid, selective and reproducible.
Key words:HPLC;stilbene glycoside; compound Yangxueshengfa tablets
复方养血生发片是由当归、地黄、五味子、制何首乌、熟地、木瓜等中药材制成的复方制剂。制何首乌具有补肝肾、益精血、乌须发的功效，主要含二苯乙烯苷(2,3,5,4′?四羟基二苯乙烯?2?O?β?D?葡萄糖苷)、大黄素、大黄酸等成分[1]。二苯乙烯苷为何首乌的特征成分,其含量测定方法有紫外分光光度法[2-3]、高效液相色谱法[4]，但在药品标准中均没有收载。本文采用高效液相色谱法对其制剂中二苯乙烯苷含量进行测定，结果发现此法操作简便、快速、准确可靠，可以作为有效的质量控制方法。
1、仪器与试药
Waters高效液相色谱仪，1525Binary Pump高压梯度泵，Rheodyne7725iw/1500Mount进样阀， 2487Dual Wavelength UV Detector检测器，Breeze data management software Add?on kit液相色谱工作站。
复方养血生发片(广东怡康制药有限公司生产)，二苯乙烯苷对照品(中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号：0844?9802)，乙腈(色谱纯，Huneywell International Inc.)，其他试剂均为分析纯。
2、方法验证与结果
2.1 色谱条件与系统适用性实验
色谱柱：Xterra column C18分析柱(5 μm，3.9 mm×150 mm);流动相：乙腈?0.1%磷酸水溶液(体积比20∶80) ;流速：1.0 mL/min;检测波长：320 nm;理论板数不低于3 000。
2.2 供试品溶液的制备
取本品20片，精密称定，研细，精密称取细粉约0.5 g，置三角瓶中，加甲醇50 mL，加热回流60 min，滤过，用少量甲醇洗涤，合并滤液和洗液，挥干，残渣加水10 mL使溶解，乙醚萃取两次，每次20 mL，水层加饱和正丁醇萃取4次，每次15 mL,合并正丁醇液，挥干，用流动相溶解，并转移至10 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
2.3 对照品溶液的制备
精密称取二苯乙烯苷对照品适量，用流动相稀释制成每1 mL含0.26 mg的溶液，即得。
2.4 线性试验
精密吸取二苯乙烯苷对照品溶液(0.26 mg/ mL)，用流动相稀释成每1 mL含二苯乙烯苷0.052、0.078、0.104、0.156、0.182 mg的溶液，按“2.1”项下色谱条件分别进样20 μL进行测定。以峰面积积分值(A)为纵坐标，二苯乙烯苷的量(m)为横坐标绘制标准曲线，得回归方程：A= 1.778×106m+6.958×104 ，r=0.999 5。表明二苯乙烯苷在1.04～3.64 μg范围内具有良好的线性关系。
2.5 稳定性试验
取供试品溶液分别于0、2、4、8、24 h进样测定，结果平均质量分数为 0.210 mg/g，RSD=1.85%，表明样品在24 h内稳定。
2.6 精密度试验
精密吸取对照品溶液20 μL，重复进样5次，测定其峰面积,结果平均峰面积为456 799.6，RSD=0.72%。
2. 7 重复性试验
配制同一批号样品5份，分别进样测定，结果平均质量分数为1.405 5 mg/g，RSD=1.85%。
2. 8 回收率试验
采用加样回收法，精密称取已知含量样品(1.405 5 mg/g)0.40 g，定量分别加入浓度为0.40、0.50、0.60 mg/mL的`二苯乙烯苷对照品溶液各1 mL，按“2.1”项下方法进样20 μL进行测定，计算回收率，结果平均回收率为99.36%，RSD=0.41%，见表1。
2. 9 样品测定
分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液20 μL，按“2.1”项下色谱条件测定，计算二苯乙烯苷含量。结果见表2。
3、讨 论
3.1 检测波长的选择
参照《中国药典2000版》中何首乌药材的含量测定方法选用320 nm为检测波长表1 二苯乙烯苷回收率试验测定结果表2 6批样品含量测定结果
3.2 提取方法的选择
比较了用甲醇为溶剂超声波处理30 min、加热回流30 min、索氏回流4 h 3种方法，甲醇加热回流所制备的供试品溶液二苯乙烯苷含量较高，故选择加热回流作为提取方法。
3.3 提取时间的选择
通过对加热回流提取30 min,60 min,90 min的比较，提取60 min，含量测定值较高，故提取时间选择为60 min。
3.4 纯化方法的选择
比较了用甲醇提取后直接进样测定，乙醚萃取后再用饱和正丁醇萃取，上氧化铝柱(200 目，10 g，d=1.5 cm)，上C18小柱(3 g)等多种方法，最后采用乙醚萃取后再用饱和正丁醇萃取的方法。
【参考文献】
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部[S].北京:化学工业出版社,2000：139.
[2] 陆瑞兰.一阶导数光谱法测定何首乌中总二苯乙烯苷的含量[J].中成药，1990(3)：16-18.
[3]白研，陈志澄，毋福海,等.广东德庆与广西宜州首乌中二苯乙烯苷含量测定[J].广东药学院学报，2002，18(2)：101-102.
[4] 张纯.高效液相色谱法测定何首乌中二苯乙烯苷的含量及其稳定性考察[J].中国中药杂志，1999(6)：37-39.
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