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苗药痛风停对SD大鼠急性痛风性关节炎的影响
【摘 要】目的：观察苗药痛风停对尿酸盐结晶诱导的SD模型大鼠急性痛风性关节炎的关节肿胀度、步态分级、滑膜病理、白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的影响，探讨苗药痛风停对急性痛风性关节炎的作用机制。方法：将60只SD大鼠随机分为空白对照组，苗药痛风停低、中、高剂量组，双氯芬酸钠组，模型对照组，每组10只。除空白对照组外，其余分别建立以尿酸盐结晶诱导的大鼠急性痛风性关节炎模型，分别观察和测量造模前及造模后6，12，24，48 h大鼠关节横径，并计算关节肿胀度;观察大鼠24，48 h步态分级;造模后48 h处死大鼠，用酶联免疫吸附法测定细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达。结果：各治疗组对大鼠关节肿胀度、步态分级、滑膜病理改变和IL-1β、IL-6、TNF-α的表达有不同程度的改善，苗药痛风停中、高剂量组与双氯芬酸钠组比较，差异无统计学意义(P > 0.05)。结论：苗药痛风停能够改善尿酸盐结晶诱导的SD模型大鼠急性痛风性关节炎关节肿胀度、步态分级及滑膜病理改变;苗药痛风停降低尿酸盐结晶诱导的SD模型大鼠细胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α的表达，以中、高剂量作用明显，并呈剂量依赖性。
【关键词】 痛风性关节炎;细胞因子;苗药痛风停;尿酸盐;实验研究
痛风(gout)是体内嘌呤代谢紊乱及/或排泄减少导致尿酸盐(monosodium urate，MSU)沉积所引起的晶体性关节病。痛风在我国的患病率约为0.15%～0.67%，较以前有明显升高[1]。痛风性关节炎常常合并有心血管疾病、高血压、2型糖尿病、肥胖、高脂血症、代谢综合征、慢性肾脏疾病和肾结石等[2]，而这些合并症往往是NSAIDs和/或秋水仙碱常见的禁忌症[3]。细胞因子白细胞介素IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等的高表达可导致、加重MSU结晶诱导的急性炎症的发生和发展[4]。中医学对痛风治疗有深入的认识，积累了丰富的临床经验。苗药痛风停根据中医理论和苗医理论对痛风认识的结合而遣方组药，由白虎加桂枝汤加减苗药组成，通过本课题组多年临床观察、临床研究和实验研究，其治疗急性痛风性关节炎疗效显著，安全性好，缓解痛风性关节炎效果明显，并具有降尿酸作用[5-7]。在前期实验研究中，笔者已经证实苗药痛风停能够抑制SD大鼠急性痛风性关节炎IL-8、环氧化酶-2(COX-2)的表达，减轻关节滑膜炎症[8-9]。本文旨在探讨苗药痛风停对IL-1β、IL-6和TNF-α的影响。
1 实验材料
1.1 实验动物 清洁级健康雌雄SD大鼠60只，体质量(200±20)g，由重庆滕鑫生物技术有限公司提供，合格证号：SCXK(渝)2014-0009。
1.2 主要试剂及仪器 尿酸钠(美国Sigma公司，批号BCBH7155V);吐温80(美国Amresco公司，批号20090120);多粘菌素B(美国Amresco公司，批号2013105156);氨基酸乙脂(上海伊卡生物技术有限公司，批号EK131219);质量分数为4%的多聚甲醛溶液(上海博谷生物科技有限公司，批号PT028);IL-1β ELISA检测试剂盒(上海研辉生物科技有限公司，批号CK-E30419R);IL-6 ELISA检测试剂盒(上海研辉生物科技有限公司，批号CK-E30646R);TNF-α ELISA检测试剂盒(上海研辉生物科技有限公司，批号CK-E30635R);酶标仪(美国BioTek有限公司，批号Synergy TM);显微镜(日本OLYMPUS公司，批号BX51T-PHD-J11);CMOS(日本OLYMPUS公司，批号BX51T-PHJ-D17);切片机(德国Leica公司，批号RM2015);冷冻离心机(北京离心机厂，批号LDZ5-2型);电子天平(瑞士METTER，批号AE100型);低温冰箱(日本SANYO公司，批号MDF-382E型);电子游标卡尺：贵阳中医学院基础实验室提供。
1.3 实验药物 苗药痛风停由生石膏15 g、知母12 g、黄柏12 g、川萆薢10 g、薏苡仁12 g、砂仁12 g、川牛膝15 g、甘草6 g等，加苗药观音草12 g、芭蕉根12 g、络石藤15 g、大血藤15 g等组成。以上生药均购于贵阳中医学院第二附属医院。取上药煎汤浓缩，质量分数按实验需求的低、中、高分组分别浓缩至1.54，3.08，6.16 g・mL-1，置于4 ℃冰箱保存。双氯芬酸钠缓释片(四川花新制药有限公司，批号H19991402)，临用时将药片充分研磨后用无菌蒸馏水配制成混悬液，然后配制成1.54 mg・mL-1的混悬液备用。
2 方 法
2.1 实验动物分组 将60只SD大鼠随机分为空白对照组，苗药痛风停低、中、高剂量组，双氯芬酸钠组，模型对照组，每组10只。
2.2 造模方法 将大鼠步态分级[10-11]作为各组SD大鼠的筛选标准，未达到0级标准的SD大鼠则剔除不用。具体造模方法：依据Mc Carty DJ[12]的经典造模方法，先用质量分数为20%的乌拉坦(5 mL・kg-1)腹腔注射麻醉，然后常规消毒大鼠右侧膝关节皮肤，稍弯曲膝关节，从关节正中或侧方用6号注射针进针，将尿酸钠溶液10 mg(0.4 mL)及多粘菌素B 0.1 mL(10 U・mL-1)注入大鼠膝关节腔，空白对照组予相同剂量的生理盐水关节腔注射。整个实验过程中，有3只大鼠因灌胃不当死亡，2只大鼠因麻醉过深死亡，为保证样本数量，及时填补。
2.3 给 药 各组SD大鼠在相同条件下自由饮食1周后，开始灌胃。根据成人与大鼠用药等效剂量换算，中剂量等于将成人用药剂量换算为大鼠用药剂量，中剂量减半则为低剂量，中剂量加倍则为高剂量。苗药痛风停低、中、高剂量组分别按质量分数不同每只灌胃2 mL，即低、中、高剂量组分别为每只1.54，3.08，6.16 g・d-1;双氯芬酸钠组灌胃剂量每只2 mL，即每只2.08 mg・d-1;空白对照组及模型对照组予以等体积的生理盐水灌胃。各组大鼠连续灌胃3 d及造模前1 h进行灌胃，每日1次。最后一次灌胃后1 h，按上述造模方法造模。造模后继续给药，每日1次，直至大鼠处死。
2.4 标本取材 将大鼠用质量分数为20%的乌拉坦(5 mL・kg-1)腹腔注射麻醉后，股动脉放血约4～6 mL，静置约1 h后，以2500 r・min-1速度离心30 min，分离血清，用于ELISA检测。大鼠放血后，将其处死，进行常规消毒，沿后肢右膝关节正中纵行剪开皮肤，暴露出膝关节，打开膝关节腔，用眼科剪取完整的关节滑膜组织，用PBS水清洗去除血迹后，置于1.5 mL预冷的离心管中，然后加用质量分数为4%的多聚甲醛约1 mL固定，迅速冻存在-80 ℃冰箱中。
2.5 检测指标 关节肿胀度：分别于造模前，造模后6，12，24，48 h用电子游标卡尺在同一部位测定膝关节横径，造模前后的差值作为关节肿胀度。大鼠步态分级：按Coderre等[11]的方法观察大鼠步态，0级，正常;1级，轻微跛行，受试下肢略有弯曲;2级，中度跛行，受试下肢刚触及地面;3级，重度跛行，受试下肢离开地面，三足着地行走。在造模后12，24 h评价大鼠步态分级。病理学检测采用HE染色，先用质量分数为4%的多聚甲醛固定组织，石蜡包埋、切片。HE染色的主要步骤如下：先用二甲苯脱蜡，无水乙醇水化，苏木素染色，盐酸酒精分化，伊红染色;之后用酒精将伊红洗掉，以酒精梯度脱水中性树胶封片后光镜下观察滑膜组织病理变化。ELISA检测血清中IL-1β、IL-6和TNF-α表达(具体操作方法按说明书进行)。
2.6 统计学方法 采用SPSS 16.0软件进行统计分析。计量资料以表示，如果符合正态分布和方差齐性，不同组间比较采用One-Way ANOVA分析;方差齐性时用LSD法检验，方差不齐性时用Tamhance's T2法检验;如果不符合正态分布，则使用非参数检验;等级资料采用Kruskal-Wallis H及Mann-Whitney U检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
3 结 果
3.1 各组大鼠关节肿胀度比较 造模后6 h，与空白对照组比较，各组关节肿胀度均不同程度升高，差异有统计学意义(P < 0.01)。造模后12 h，与空白对照组比较，各组关节肿胀度继续升高，差异有统计学意义(P < 0.01);与模型对照组比较，各治疗组关节肿胀度差异有统计学意义(P < 0.01);与双氯芬酸钠组比较，苗药痛风停低、中、高剂量组关节肿胀度差异无统计学意义(P > 0.05)。造模后24 h，各组关节肿胀度继续升高，其中模型对照组关节肿胀度达到最高峰，与空白对照组比较，各组关节肿胀度差异均有统计学意义(P < 0.01);与模型对照组比较，各治疗组关节肿胀度差异有统计学意义(P < 0.01);与双氯芬酸钠组比较，苗药痛风停中、高剂量组关节肿胀度差异无统计学意义(P > 0.05);苗药痛风停低剂量组关节肿胀度差异有统计学意义(P < 0.05)。之后各组大鼠关节肿胀开始下降，造模后48 h，模型对照组关节肿胀度继续下降，与空白对照组比较，差异仍有统计学意义(P < 0.01);与模型对照组比较，双氯芬酸钠组，苗药痛风停中、高剂量组关节肿胀度下降明显，差异有统计学意义(P < 0.01)，苗药痛风停低剂量组关节肿胀度差异无统计学意义(P > 0.05);与双氯芬酸钠组比较，苗药痛风停中、高剂量组关节肿胀度差异无统计学意义(P > 0.05);与苗药痛风停高剂量比较，中剂量组关节肿胀度差异无统计学意义(P > 0.05);与苗药痛风停低剂量组比较，中剂量组关节肿胀度差异有统计学意义(P < 0.01)。见表1。 3.2 各组大鼠步态分级比较 大鼠步态分级统计采用多个独立样本的非参数检验，造模后24 h，观察各组大鼠步态，总体样本差异有统计学意义(χ2 = 29.800，P < 0.01);与空白对照组比较，各造模组差异有统计学意义(P < 0.01);与模型对照组比较，各治疗组差异有统计学意义(P < 0.01);各治疗组之间比较，差异无统计学意义(P > 0.05)。经造模后48 h，总体样本差异无统计学意义(χ2 = 5.102，P > 0.05)，说明48 h后各组大鼠跛行步态逐渐缓解。见表2。
3.3 滑膜组织病理学形态改变 HE染色后，空白对照组关节滑膜组织光滑完整、无增生，可见少量炎性细胞浸润、无血管增生及纤维素渗出;苗药痛风停各剂量组及双氯芬酸钠组滑膜组织充血水肿，成纤维细胞增生，炎性细胞浸润减少，程度比模型对照组减轻;模型对照组滑膜充血水肿、周围毛细血管扩张，大量炎性细胞浸润，主要为中性粒细胞。滑膜病理学显示，苗药痛风停不同剂量均能减轻滑膜组织充血水肿及毛细血管扩张，炎性细胞浸润，减轻滑膜病理损害，从而减轻炎症反应。见图1。
3.4 各组大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α表达情况 ELISA检测结果显示，IL-1β、IL-6和TNF-α表达量均增高，与空白对照组比较，模型对照组差异有统计学意义(P < 0.01);与模型对照组比较，各治疗组IL-1β、IL-6和TNF-α的表达量均有下降，差异有统计学意义(P < 0.01);与双氯芬酸钠组比较，苗药痛风停中、高剂量组差异无统计学意义(P > 0.05);与苗药痛风停高剂量组比较，中剂量组差异无统计学意义(P > 0.05)，低剂量组差异有统计学意义(P < 0.01)。见表3。
4 讨 论
IL-1β是最经典的炎症调节剂，是调节炎症的始动因素，在痛风性关节炎中，活化的IL-1β能调节其他细胞因子和炎症趋化因子，募集中性粒细胞进入MSU结晶沉积部位，放大炎症反应，从而加重关节炎症[13]。IL-1β是痛风性关节炎发病过程中的关键因子，在急慢性痛风性关节炎中起重要作用，对痛风性关节炎的形成和关节破坏发挥重要作用[14]，采用IL-1抑制剂治疗痛风性关节炎取得了满意的临床疗效[15]。IL-6也参与了痛风的发生发展，当痛风性关节炎等病情活动或关节破坏严重时，血清与关节液中IL-6的水平升高，IL-6作为判断痛风性关节炎疾病活动性和严重程度的指标[16]。MSU晶体使滑膜细胞和单核细胞生成IL-6增加。最新研究显示，托珠单抗治疗痛风性关节炎后患者血清IL-6降低，痛风石大小有所减小，不发热，在此过程中患者没有急性痛风性关节炎的发作[17]。TNF-α是炎性细胞因子网链中的第1个细胞因子，不仅启动炎症反应，而且能诱导其他细胞因子如IL-1β、IL-6、IL-8等炎症细胞因子的过度表达，导致炎症反应进一步扩大[18]。在MSU晶体诱导的痛风模型中，如果阻断TNF-α的产生，则E-选择素的表达和中性粒细胞的募集明显地受到抑制，证明了TNF-α在痛风性关节炎的发病中发挥重要作用。TNF-α抑制剂对于复杂的痛风性关节炎能够有效缓解临床症状，并且抑制MSU的继续沉积[19]。中医学认为，痛风的发病机制主要是饮食不节，过食肥甘厚味、辛辣之品，加上外感风寒湿邪气，损伤脾胃，脾失健运，湿浊内滞，聚于关节，湿聚成痰，痰湿为有形之邪，痹阻日久，气血运行不畅，则生瘀血，痰湿与瘀血互结阻滞脏腑经络气血津液运行，机体代谢紊乱，则发为痛风。痰湿与瘀血互结则痛风长期不愈，反复发作。苗医认为，疾病是由不良的生存环境、季节气候因素和外来毒素(如风毒、气毒、寒毒、水毒)等引起人体的损伤。苗药痛风停由经方白虎加桂枝汤加减苗药观音草、芭蕉根、络石藤、大血藤等组成，综观全方共奏清热解毒、健脾利湿、活血化瘀之效。
本实验采用ELISA检测显示，与空白对照组比较，模型对照组差异有统计学意义(P < 0.01)，说明造模是成功的，各治疗组IL-1β、IL-6和TNF-α表达均有所下降，以苗药痛风停中、高剂量组显著。各造模组大鼠关节肿胀度在造模后6 h开始肿胀，12 h后继续升高，24 h达到高峰，48 h后逐渐缓解，在造模后12 h，各治疗组关节肿胀明显低于模型对照组(P < 0.01)，在24 h和48 h分别表现出以苗药痛风停中、高剂量组缓解明显。而各组大鼠步态分级则以24 h模型对照组明显，出现中、重度跛行，各治疗组跛行程度较轻，48 h后基本缓解，苗药痛风停可明显缓解大鼠关节肿胀度和步态分级。通过病理学观察显示，各治疗组滑膜组织充血、水肿，炎症细胞浸润较模型对照组减轻，说明苗药痛风停能够改善滑膜病理损害，减轻炎症反应。综上所述，笔者推测苗药痛风停对MSU诱导的SD大鼠急性痛风性关节炎的改善可能是通过抑制下游细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达减轻炎症反应而实现的，并呈现出剂量依赖性。
5 参考文献
[1] 中华医学会风湿病学分会.原发性痛风诊断和治疗指南[J].中华风湿病学杂志，2011，15(6)：410-411.
[2] Keenan RT，O'Brien WR，Lee KH，et al.Prevalence of contraindications and prescription of pharmacologic therapies for gout[J].Am J Med，2011，124(2)：155-163.
[3] Richette P，Bardin T.Should prednisolone be first-line therapy for acute gout?[J].Lancet，2008，372(9646)：1301-1301.
[4] Liu R，O'Connell M，Johnson K，et al.Extracellular signal-regulated kinase 1/extracellular signal-regulated kinase 2 mitogen-activated protein kinase signaling and activation of activator protein 1 and nuclear factor kappaB transcription factors play central roles in interlerkin-8 expression stimulated by monosodium urate monohydrate and calcium pyrophosphate crystals in monocytic cells[J].Arthritis Rheum，2000，43(5)：1145-1155.
[5] 曹跃朋，黄华，钟琴，等.苗药痛风停汤治疗痛风性关节炎60例[J].风湿病与关节炎，2013，2(5)：5-6，10.
[6] 付德红，钟琴，马武开，等.苗药痛风停汤内服配合水晶膏外敷治疗急性痛风性关节炎疗效观察[J].世界中西医结合杂志，2012，7(6)：494-496.
[7] 钟琴，刘正奇，刘汉顺，等.痛风停胶囊配合金黄膏外敷治疗痛风35例[J].当代医学：学术版，2008，15(9)：154-155.
[8] 钟琴，刘正奇，安阳，等.苗药痛风停汤对急性痛风性关节炎模型大鼠血清IL-8的影响[J].风湿病与关节炎，2014，3(1)：16-18.
[9] 刘正奇，钟琴，马武开，等.苗药痛风停汤对急性痛风性关节炎SD模型大鼠关节滑膜COX-2表达的影响[J].亚太传统医药，2014，10(4)：27-29.
[10] Coderre TJ，Wall PD.Ankle joint urate arthritis(AJUA) in rat：analternative animal model of arthritis to that produce by Freund's adjuvant[J].Pain，1987，28(3)：379-393.
[11] Coderre TJ，Wall PD.Ankle joint urate arthritis in rats provides a useful tool for the evaluation of analgesic and anti-arthritic agents[J].Pharmmacol Biochem Behav，1988，29(3)：461-466.
[12] 金沈锐，秦旭华.痛风及高尿酸血症动物模型的研究现状和评价[J].中国实验动物学报，2005，13(1)：55-58.
[13] Church LD，Cook GP，McDermott MF.Primer：inflammasomes and interleukin 1beta in inflammatory disorders[J].Nat Clin Pract Rheumatol，2008，4(1)：34-42.
[14] Chen CJ，Shi Y，Hearn A，et al.MyD88-dependent IL-1 receptor signaling is essential for gouty inflammation stimulated by monosodium urate crystals[J].J Clin Invest，2006，116(8)：2262-2271.
[15] Terkeltaub R，Sundy JS，Schumacher HR，et al.The interleukin 1 inhibitor rilonacept in treatment of chronic gouty arthritis：results of a placebo-controlled，monosequence crossover，non-randomised，single-blind pilot study[J].Ann Rheum Dis，2009，68(10)：1613-1617.
[16] Takahashi M.Inflammatory cytokines in the pathogenesis of atherosclerosis[J].Nihon Rinsho，2011，69(1)：30-33.
[17] Mokuda S，Kanno M，Takasugi K，et al.Tocilizumab improved clinical symptoms of a patient with systemic tophaceous gout who had symmetric polyarthritis and fever：An alternative treatment by blockade of interleukin-6 signaling[J].SAGE Open Medical Case Reports，2014，2：2050313X13519774.
[18] Li X，Huang Q，Ong CN，et al.Chrysin sensitizes tumor necrosis factor-α-induced apoptosis in human tumor cells via suppression of nuclear factor-kappaB[J].Cancer Lett，2010，293(1)：109-116.
[19] Tausche AK，Richter K，Gr?ssler A，et al.Severe gouty arthritis refractory to anti-inflammatory drugs：treatment with anti-tumour necrosis factor alpha as a new therapeutic option[J].Ann Rheum Dis，2004，63(10)：1351-1352.
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