柳茶多糖的分离纯化及气相色谱-质谱分析
目的探索川麦冬须根普通粉和超细微粉间表面特性和溶出性的差异，以便更好地利用川麦冬须根资源。方法通过普通光学显微镜、电子显微镜对普通粉和超细微粉的形态学观察，通过对粒径、分布宽度、比表面积、松密度、压缩度及其浸出物测定等方法对其普通粉和超细微粉进行比较分析。下面是小编搜集整理的相关内容的论文，欢迎大家阅读参考。
【摘要】 目的首次提取柳茶中的水溶性粗多糖并进行分离、纯化及组成分析。方法柳茶经热水提取、乙醇沉淀、Sevag法去蛋白、H2O2脱色，逆向流水透析得多糖精制品。将精多糖衍生化后运用气相色谱-质谱法对其化学成分进行分析。结果确定了柳茶中水溶性多糖分别由核糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，其中以核糖、葡糖糖、半乳糖为主。结论该方法简便、灵敏，可以准确测定出柳茶多糖中所含有的各种单糖。
【关键词】 柳茶多糖; 纯化; 气相色谱-质谱; 单糖
柳茶为藏族民间常用药，以蔷薇科(Rosaceae)鲜卑花属(Sibiraea)植物窄叶鲜卑花Sibiraea angustata (Rehd.) Hand-Mazz. 和鲜卑花Sibiraea laecigata (L) Maxim.的枝叶及果序(带果实的果枝)入药，主要用于消食导滞、疏散风热;据藏药文献记载，柳茶主治热病和疫病[1]。现藏族民间常作茶饮，治疗食后腹胀等诸多原因引起的消化不良，每每见效。柳茶中除含有挥发油、微量元素外，通过实验发现还含有丰富的多糖。多糖作为提高机体免疫功能的保健品已被许多人接受，但许多多糖产品仅仅停留在保健品阶段，未能开发成药物，主要原因是多糖的分离纯化困难，技术不过关。因此本文旨在对柳茶多糖的提取、纯化、组分分析进行研究并对其营养保健功能进行探讨，以期为柳茶的开发及其综合利用提供参考。
一、仪器与材料
1.1 仪器 UV-2450紫外分光光度计(日本岛津) ; NE2155电子天平(德国赛多利斯仪器公司);Agilent 5793I-6890气相色谱-质谱联用仪(GC-MS);SE-54弹性石英毛细管柱(50 m×0.25 mm id×0.50 μm);高纯氦(纯度≥99.999%);旋转蒸发仪(上海青浦泸西仪器厂)。
1.2 材料 鲜卑花属植物叶采自甘肃省甘南藏族自治州合作市郊，海拔3 200 m以上。经兰州大学药学院生药学研究所杨永建教授鉴定其为蔷薇科(Rosaceae)鲜卑花属(Sibiraea)植物窄叶鲜卑花Sibiraea angustata (Rehd.) Hand-Mazz. 和鲜卑花Sibiraea laecigata (L) Maxim.的叶。
单糖标准品葡糖糖、阿拉伯糖、核糖、甘露糖、木糖、果糖、半乳糖标准品 (Fluka公司)，盐酸羟胺、吡啶、三氟乙酸、乙酸酐、氯仿以及其他试剂等均为国产分析纯，蒸馏水为实验室自制。
二、方法
2.1 多糖的提取与纯化
2.1.1 粗多糖的提取取一定量的柳茶依次用石油醚、乙醚除去脂溶性杂质。加10倍量的水90～100℃提取3次，3 h/次，合并水提液，过滤。70℃水浴减压浓缩至适量，加入5倍量95 %的乙醇纯析，静置过夜，离心过滤，置真空冷冻干燥得柳茶多糖粗品。
2.1.2 粗多糖纯化[2]将多糖粗品溶于蒸馏水，去不溶物，按Sevag法(氯仿∶正丁醇=4∶1)脱蛋白，重复10次以上，然后移至透析袋中用去离子水逆流透析24 h，直至紫外光谱分析检测无蛋白吸收。以氨水调节pH为8，滴加H2O2，50℃保温脱色2 h，减压浓缩，加入5倍量的无水乙醇，静置过夜，离心收集沉淀，将沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚漂洗2次，冷冻干燥得去蛋白多糖纯品。
2.1.3 紫外光谱分析 取柳茶多糖适量，加水溶解，配制成浓度为1.0 g/L的多糖水溶液，采用紫外可见分光光度法190～700 nm范围内扫描。光谱显示柳茶多糖具有多糖特征性的'紫外吸收图谱仅在200 nm处有一锐细吸收峰，大于250 nm无明显的紫外吸收，是平坦的背景。结果表明，提取纯化的多糖中不含有核酸、蛋白质以及其他杂质成分。
2.2 柳茶多糖的气相色谱质谱测定
2.2.1 供试品溶液(糖腈乙酰酯衍生物)的制备称取20 mg柳茶纯化多糖样品溶于2 ml 2 mo1/L的TFA中，封管，于100℃水解6 h，减压除尽TFA。在水解产物中加入20 mg盐酸羟胺和1 ml吡啶，封管于90℃反应30 min。冷至室温，再加入1 ml乙酸酐，封管于90℃反应30 min，冷却后转出上层清液，减压浓缩至干。滴入0.5 ml氯仿溶解后进行气相色谱——质谱分析。
2.2.2 对照品溶液的制备精密称取单糖标准品葡糖糖、阿拉伯糖、核糖、甘露糖、木糖、果糖、半乳糖对照品20 mg，采用上述方法制备乙酰化衍生物，氯仿溶解后进行气相色谱—质谱分析。
2.3 GC-MS分析条件
2.3.1 色谱条件SE-54毛细管柱，气化室温度270℃，柱前压17.8 kPa，分流比30∶1，采用恒流模式载气He流量1.2 ml/min，进样量1 μl，程序升温：起始温度100℃保持6 min，以20℃/ min 升至220℃保持14 min，以5℃/ min 升至290℃。
2.3.2 质谱条件电子轰击源(EI)，电子能量70 eV ;离子源温度：230℃;四极杆温度：150℃;传输杆温度：280℃;扫描范围：14～400 amu。
三、结果
3.1 单糖标准品和柳茶多糖的GC—MS分析
3.1.1 混合单糖标准品乙酰化衍生物的总离子流图见图1。根据单糖标准品的乙酰化衍生物的GC-MS的总离子流图，确定7种混合单糖标准品的GC一MS总离子流图的出峰顺序为果糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。
3.1.2 柳茶多糖的乙酰化衍生物的总离子流图见图2。根据柳茶多糖的总离子流图，通过各峰的保留时间和标准质谱尼斯特谱库(NIST)对照分析可以确定其含有核糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，出峰时间及其组成含量见表1。
四、 讨论
分析多糖中单糖组成，首要的工作就是将多糖样品进行彻底的水解。因为如果水解效果不理想，多糖很难完全水解为单糖或者仅仅有很少部分水解，导致样品水解衍生化产物在气相色谱分析中峰值很小，从而影响多糖中含量较少的单糖测定。通过对影响水解效果的各种因素的综合考察分析，得出对于柳茶多糖的水解应采用2 ml 2mo1/L的TFA水解6 h较为合适。在此水解条件下，可以使多糖较为完全地水解。而硫酸也可用于多糖的水解，但实验时采用低浓度的硫酸水解时效果不理想，高浓度的硫酸则易造成多糖的碳化。且由于硫酸沸点比较高，水解后残留的酸不容易挥发除去，必须用碳酸钡中和处理，容易造成样品组分的损失。
柳茶多糖中的单糖含量
柳茶多糖在空气中提取或干燥时颜色会加深，可用过氧化氢或活性炭脱色，活性炭在脱色时使用量大，样品损失较多，故采用H2O2脱色。在用过氧化氢脱色处理后，一定要透析至无过氧化氢检出，H2O2检出用高锰酸钾法。此外，在醇洗及醚洗、抽滤时用薄膜盖住样品，可减少空气接触，防止颜色加深。在脱色时50℃保温脱色2 h，时间短色素太多影响检测结果，时间长也没有更好的脱色效果。
柳茶中除含有挥发油、微量元素、三萜类化合物等多种化学成分外，课题组发现其所含多糖也是其主要活性成分之一;多糖作为药物应用是在20世纪40年代，自20世纪60年代以来，人们陆续发现多糖具有更多的生物活性。不仅具有免疫调节功能，还可以抗感染、降血糖和抗肿瘤等，随着多糖类化合物研究的深入，其在抗肿瘤和病毒的临床治疗方面显示了广阔的应用前景。本文首次对柳茶多糖的化学组成进行研究，对开发利用本地资源有一定的意义。对其化学结构的进一步研究，将有利于阐明其活性与成分的关系。
【参考文献】
[1] 甘肃省卫生局.甘肃中草药手册，第3册[M].兰州：甘肃人民出版社，1973：1554.
[2] 方积年,丁 侃.天然药物-多糖的主要生物活性及分离纯化方法[J].中国天然药物,2007,95(5):338.
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