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冠心病痰瘀证与载脂蛋白E基因多态性关系的研究
关载脂蛋白E（apolipoprotein E, ApoE）作为脂蛋白的组成部分和功能蛋白，对血脂代谢起调节作用, 编码ApoE基因的变异是影响血浆胆固醇浓度的重要遗传因素之一。已有报道证实：不同遗传背景人群的ApoE的基因多态性通过影响脂质代谢而与冠心病(coronary heart disease, CHD)的发病密切相关［1~3］。证候是中医认识和治疗疾病的根本，冠心病患者的临床表现以血瘀证和痰瘀互阻证为多见［4］。本研究对冠心病不同证候的发生和ApoE基因多态性的相关性进行了探讨，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 病例纳入标准 选择在北京西苑医院和北京东方医院就诊的心肌梗死患者、或经冠状动脉造影及介入治疗确诊为冠心病的患者，这些患者均符合1999年美国心脏病协会AHA/WHO公布的冠心病分型和诊断标准［5］。然后对这些患者进行中医辨证确定证候类型。痰证、血瘀证、痰瘀互阻证、气虚证、阳虚证、阴虚证、气滞证、寒凝证等参考国家技术监督局发布的《中医临床诊疗术语・证候部分》（国家标准GB/T16751.21997）。
1.2 病例排除标准 半年内曾有严重创伤或重大手术者；肾病综合征，甲状腺功能减退症，急性肝胆疾病及糖尿病患者；服用药物影响血脂代谢的患者；正在使用影响血脂代谢药物的患者。
1.3 病例资料 按上述标准纳入不同证候类型的冠心病患者共200例，其中男105例，女95例；平均年龄(63.6±5.8)岁；其中痰证20例（10%），瘀证79例（39.5%），痰瘀互阻证82例（41%），非痰非瘀证19例（9.5%）；身体质量指数（body mass index, BMI）为15.1～34.3 kg/m2。另选100名健康体检者作为对照组，其中男55名，女45名；平均年龄(62.1±7.8)岁；均无冠心病症状，常规心电图及超声心动图检查正常。以上样本人群均来自北京和河北地区，汉族，无血缘关系。所有病例均作标准基线问卷调查，结果记录于按临床流行病学要求设计的表格上。医师、患者和实验研究人员之间实行盲法。
1.4 材料
1.4.1 主要试剂 血清总胆固醇（total cholesterol, TC）和总甘油三酯（total triglycerides, TG）测定试剂盒购自法国申能公司；高密度脂蛋白胆固醇（highdensity lipoprotein cholesterol, HDLC）和低密度脂蛋白胆固醇（lowdensity lipoprotein cholesterol, LDLC）测定试剂盒由日本第一化学药品株式会社提供；血脂测定多项质控物由卫生部临床检验中心提供；全血DNA纯化试剂盒（Wizard genomic DNA purification kit）、Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA分子量Marker（PCR Marker和pBR322Hae Ⅲ Marker）以及限制性内切酶HhaI均购自美国Promega公司；丙烯酰胺和NN’甲叉双丙烯酰胺，均购自北京鼎国生物技术公司。
1.4.2 血样采集 患者空腹12 h后，静脉抽取2 ml血样，乙二胺四乙酸抗凝，用于提取DNA。
1.4.3 引物 根据Richard 等［6］设计引物，序列为P1：5’AACAACTGACCCCGGTGGCG 3’；P2：5’ ATGGCGCTGAGGCCGCGCTC 3’，均由北京鼎国生物技术公司合成。
1.5 方法
1.5.1 血脂水平的测定 测定TG采用胆固醇氧化酶过氧化物酶4氨基安替比林和酚法；测定TC采用脂蛋白脂肪酶甘油磷酸氧化酶过氧化物酶4氨基安替比林和酚法（GPOPAP酶法）；测定HDLC采用选择性抑制法；测定LDLC采用选择性反应法。致动脉粥样硬化指数（atherogenic index, AI）的计算公式为：AI=（TC－HDLC）/HDLC。
1.5.2 ApoE基因型的测定 采用全血DNA纯化试剂盒提取全血DNA。按《现代心脏内科学》［5］中的条件扩增ApoE基因的目的片段。反应体系：10倍缓冲液2 μl，浓度为2 mmol/L的dNTPs 2 μl，二甲基亚砜2 μl，浓度为2 μmol/L的引物各0.25 μl，2 U Taq酶，DNA模板100～200 ng，总体积20 μl。循环条件：95 ℃预变性8 min，然后95 ℃ 45 s、60 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s，共35个循环后，72 ℃延伸8 min。经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）检验扩增结果。取10 μl PCR产物加入10倍酶切缓冲液2 μl，小牛血清0.2 μl，浓度为10 U/μl的HhaI 0.5μl，去离子水7.3 μl。37 ℃反应4 h。产物用15% PAGE检测其基因型。
1.5.3 样品测序 随机选取各基因型的PCR产物送北京鼎国生物技术公司进行序列测定。
1.6 统计学方法 所有资料均采用SAS软件包进行分析。等位基因频率计算采用频率记数法；基因型，基因分布频率及基因和证候的相关性分析用χ2检验。不同基因型之间血脂的均数比较采用单因素方差分析。
2 结果
2.1 ApoE基因目的片段PCR扩增结果 所有300例血样均获得了阳性扩增条带，目的片段分子量为292 bp。见图1。
2.2 PCR产物HhaI酶切分型结果 在300例样品中共检测出6种ApoE基因型，分别为E 3/3、E 4/4、E 2/3、E 2/4、E 2/2、E 3/4型，等位基因分别为ε2、ε3和ε4。见图2。图3为E 4/4型的5’端正向测序结果扫描图。将所有结果与GeneBank中已知的ApoE基因第4外显子对应部分序列进行比对，多态性位点碱基吻合，分型结果准确。
2.3 ApoE基因型与等位基因频率分布 CHD患者中ApoE 3/4基因型和ApoE ε4等位基因频率明显高于健康对照组（P<0.01, P<0.05），OR(Odds Ratio, 优势比也称比值比)值为2.9924，采用MantelHaenszel方法算得95％的可信区间为［1.6508, 5.4242］，使用CochranMantelHaenszel法得到P值为0.0002，表明ε4变异基因和CHD发病显著相关。见表1。
2.4 ApoE基因多态性对血脂水平的影响 分析携带和不携带ε4等位基因患者的血脂水平，结果显示携带ε4等位基因者TC、TG、LDLC和AI明显升高（P<0.05或P<0.01）；而HDLC降低，但无统计学差异。表明ε4等位基因具有“升高血脂”的作用，可加重动脉粥样硬化的程度和提高发病风险。见表2。
2.5 ApoE基因型与等位基因频率在不同证候中的分布 E 3/4基因型和ε4等位基因频率在痰证（syndrome of phlegm, PS）患者中明显高于瘀证（syndrome of blood stasis, BSS）患者(P<0.05)，而E 3/4基因型在非痰非瘀证患者（syndrome of nonphlegm and nonblood stasis, NPNBS）中的频率则明显高于瘀证和痰瘀互阻证（syndrome of phlegmblood stasis blocking, PBBS）患者(P<0.05)，但未见其在ε4等位基因频率间有统计学差异。见表3。
图1 ApoE基因第4外显子目的片段PCR扩增结果电泳图（略）
Fig 1 PCR amplification results of ApoE exon 4 target fragment
M: PCR marker; 1: PCR products; 2: PCR products
图2 ApoE基因第4外显子目的片段PCR产物的HhaI酶切分型结果电泳图（略）
Fig 2 HhaI RFLP results of ApoE exon 4 PCR products
M: pBR322Hae Ⅲ marker; 1: Genotype E 3/3; 2: Genotype E 2/3;3: Genotype E 2/4; 4: Genotype E 2/2; 5: Genotype E 3/4;6: Genotype E 4/4
图3 ApoE E 4/4基因型样品的DNA测序图谱（略）
Fig 3 Sequence mapping of genotype E 4/4 of ApoE
表1 ApoE基因型及等位基因频率分布（略）
Tab 1 Frequency distribution of ApoE exon 4 genotypes and alleles in CHD group and control group
*P<0.05, **P<0.01, vs control group
表 2 ε4等位基因对血脂水平的影响（略）
Tab 2 Comparison of serum lipid level between patients in CHD group with and without ε4 allele
*P<0.05, **P<0.01, vs E 2/2＋E 2/3＋E 3/3 group
表3 各证候组ApoE第4外显子基因型和等位基因频率分布（略）
Tab 3 Frequency distribution of apoE exon 4 genotypes and alleles in CHD patients with different syndromes
*P<0.05, vs PBBS group; △P<0.05, vs BSS group
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