- 相关推荐
VPA解除Met对大鼠皮质神经元GAD表达的抑制
【关键词】 丙戊酸；蛋氨酸；谷氨酸脱羧酶；精神分裂症
Valproate renew GAD expression which had been inhibited by methionine in mouse primary cortical cultures
【Abstract】 Objective To study valproate and methionine(Met) regulate glutamic acid decarboxylase (GAD) expression in mouse primary cortical cultures nouron，investigate the mechanism of the VPA’s function in the treatment of schizophrenia.Methods Adopting primary cortical cultures technique cultures neuron，collecte cells，lysis cells，use colorimetric method to measure GAD activities；analyse GAD activities of the vacancy group（serum-free DMEM），the Met group（cultures were incubated with Met at a final concentration of 2 mM in serum-free DMEM for 3days，after that change it with serum-free DMEM），and the VPA group（cultures were incubated with VPA at a final concentration of 2 mM in DMEM after that incubated with Met at a final concentration of 2 mM in serum-free DMEM for 3days）.Results In the Met group the average activities of GAD is obviously lower than the other two group，the difference has statistical meaning. In the VPA group the average activities of GAD is approach to vacancy group，the difference hasn’t statistical meaning.Conclusion The methionine inhibits the cortical neuron express GAD，decreases GABA synthesize. The VPA promotes the cortical neuron expression GAD，and renews GAD expression which had been inhibited by Met in mouse primary cortical cultures.
【Key words】 valproate；methionine；glutamic acid decarboxylase（GAD）；schizophrenia
增加蛋氨酸（Methionine，Met）的摄入量，会造成近百分之七十的精神分裂症（schizophrenia，SZ）患者症状恶化［1］。有学者认为的大量摄入Met引起大鼠体内活性甲基供给体S-腺苷同型半胱氨酸（SAM）增加，SAM使谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase.GAD)等基因启动区甲基化修饰，引起GAD等基因表达降低［2］。在美国医生普遍使用丙戊酸(valproic acid，VPA）辅助治疗SZ。2001年Christopher［3］发现VPA能抑制组蛋白去乙酰基酶（Histone Deacetylase，HDACs)的活性，从而诱导基因表达。笔者通过原代培养技术培养大鼠皮质神经元，并在培养液中先后加入Met、VPA，然后用Berthelot［4］ 反应测定不同组别的皮质神经元裂解液的GAD相对酶活性。如果Met 能抑制GAD基因表达，将使皮质神经元中GAD的相对酶活性降低，而如果VPA能诱导GAD基因表达，将使GAD恢复到正常水平。
1 材料与方法
1.1 试剂 多聚左旋赖氨酸，N2添加剂(100×的成分: 牛胰岛素500μg/ml，人转铁蛋白10000μg/ml，黄体酮0.63μg/ml，硒0.52μg/ml，腐胺 1611μg/ml，Gibco)，基础培养液（DMEM、碳酸氢钠、青霉素、链霉素），胎牛血清，兔抗GABA 血清(1∶600)，羊抗兔IgG (1∶40)，免疫组织化学试剂盒，Met、Gly 标准品，苯甲基磺酰氟(PMSF)，非变性条件下裂解细胞的裂解液（pH 7.0的20mM Tris，150mM NaCl，1% Triton X-100，焦酸钠，β-甘油磷酸，EDTA，Na3VO4，等），GABA (纯度99.9 %)，5′-磷酸吡哆醛(PLP)，L-谷氨酸钠 (L-MSG)，次氯酸钠，Folin－酚试剂，牛血清白蛋白，巯基乙醇，重蒸酚，无水乙醇等。
1.2 动物 孕期16～18天清洁级SD大鼠，由郑州大学动物中心提供。
1.3 方法
1.3.1 大鼠皮质神经元分组培养 大鼠皮质神经元的体外培养参照陈丽敏［5］ 完全培养液组的培养方法。以5×105/孔的数量接种大鼠皮质神经元于多聚左旋赖氨酸处理过的24孔培养板。以新配制的完全培养液(基础培养液 N2添加剂 10%胎牛血清)培养细胞，3天后换以无血清培养液（基础培养液 N2添加剂）分组继续培养。实验分三组，每组8个孔:空白组，无血清培养液；Met组，无血清培养液含终浓度为2mM的MET，培养3天后换以无血清培养液；VPA组，无血清培养液含终浓度为2mM的Met，培养3天后换以终浓度为0.5mM的VPA的无血清培养液。将细胞放置于温度37℃、体积分数为5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养。分组培养6天后将细胞用于各类实验。
1.3.2 GABA能神经元的免疫细胞化学(PAP法)鉴定 培养细胞用4%多聚甲醛固定，0.2% Triton X-100和0.03% H2O2/甲醇溶液于室温下处理30min，羊血清蛋白(1∶50)37℃ 1h，经兔抗GABA血清(1∶600)4℃孵育72h，再经羊抗兔IgG(1∶40)37℃ 1h，兔抗PAP复合物(1∶40)37℃ 1h，用DAB 4HCl/H2O2(0.05%/0.01%)呈色35min，贴片、脱水、透明及封片。上述每步骤间均用PBS充分洗涤，光镜下观察。
1.3.3 谷氨酸脱羧酶活性的测定 （1）粗酶提取液的制备：去除培养液，用PBS、生理盐水（含最终浓度为1mM的PMSF）洗一遍细胞。每孔加入100μl非变性条件下裂解细胞的裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。裂解液接触细胞2s后，细胞就会被裂解。于4000r/min 下离心5min，得到的上清液即为粗酶液。裂解细胞的所有步骤都在冰上进行。采用Lowry 法测定蛋白质浓度后，用磷酸盐缓冲液稀释到3g蛋白/L。冰箱短时间保存备用。（2）采用比色法测定粗酶提取液谷氨酸脱羧酶的活性：取0.2ml 50mmol/L的磷酸缓冲液(pH 6.8)，其中含5mmol/L L-MSG及0.2mmol/L 的PLP，加入0.1ml 待测粗酶提取液和0.1ml 蒸馏水（对照组加入0.1ml 2mM的Met，实验组加入0.1ml 2mM的Gly），于37℃水浴中保温30min；迅速置于冰浴中止反应，加入0.2ml 0.2mmol/L pH 9.0 的硼酸缓冲液，1ml 6%的重蒸酚溶液，0.4ml次氯酸钠溶液，充分振荡；沸水浴10min 后，冰浴20min不断振荡，直至有蓝绿色化合物出现，然后加入2ml 60%的乙醇于645nm 下比色。以已知浓度的GABA 作对照。在上述测定条件下，以每分钟生成1μmol 的GABA 所需的酶量为一个酶活单位(U)。每组测定同时做3次重复，求平均值。
1.3.4 统计学方法 全部数据以（x±s）表示，采用SPSS10.0 统计软件，平均数比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有显著性。
下一页
【VPA解除Met对大鼠皮质神经元GAD表达的抑制】相关文章：
δ-连环素在糖尿病大鼠海马神经元中的表达03-18
硫化氢供体抑制低氧大鼠尾加压素II表达03-08
calpain抑制剂（ALLN）对大鼠离体心脏缺血/再灌注损伤的保护作用03-08
整合素基因在脓毒症大鼠心脏中的表达变化03-08