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浅谈基因定位技术在遗传病诊断中的应用
[论文关键词] 荧光PCR定量技术；基因定位技术；遗传病
[论文摘要] 荧光PCR定量技术(Quantitative PCR)是一种新兴的基因定位技术。这项技术灵敏、简便、快速、不需使用放射性同位素，PCR完成后，通过测序仪的自动识别即可对待测DNA进行定量分析。在遗传病，特别是一些以大片段缺失为主要突变类型的遗传病诊断中，荧光PCR定量技术发挥了很重要的作用。
在早期的遗传学分子诊断中，主要依赖于Southern Blotting，寡核苷酸杂交等技术。自1985年Saiki等首次描述聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)以来，PCR技术因为其灵敏特异，省时省力等诸多优点而受到了人们的高度重视，已经应用于生物和化学等基础研究的各个领域，并且成为医学和法医学研究的强有力分析工具之一[1-3]。然而，近几年来，研究者们不再满足于得知某一特异DNA序列的存在与否，他们更着眼于对其进行精确的核酸定量。尽管把PCR作为一种定量的工具，在技术上还面临着一些挑战。荧光PCR基因定位技术是近十余年来兴起的一种分子生物学技术，与其他定量方法相比，具有灵敏、简便、快速、不需使用放射性同
位素的特点，在基因表达、传染病和遗传病的诊断等方面迅速得到了广泛应用。
1 荧光PCR基因定位技术的原理
荧光PCR定量技术的主要原理为：在PCR前，通过化学方法在引物的5’端通过共价方式连接一个荧光分子。由于在进行PCR时，引物和待扩增模板5’端的碱基不需要完全匹配，荧光PCR引物和普通PCR引物一样，能够对待测模板进行指数扩增。扩增完成后，根据PCR的产量，将荧光PCR产物直接或按一定比例稀释后，和内标、载样缓冲液混合，在自动测序仪上进行电泳。在自动测序仪内激光的激发下，PCR产物上的荧光分子发出固定波长的激发光，被仪器内的光电管捕获。根据PCR产物从开始电泳到经过光电管的时间，测序仪自动计算出相应产物的实际碱基数。不同泳道之间电泳速度的差别，通过各产物内混合的内标校正。同时，测序仪也自动标出相应产物的荧光强度，该数值就是荧光PCR定量技术对模板进行定量与定位的基础。与非定量PCR分析方法不同，荧光PCR的操作程序有助于评估污染的情况，即测出污染的程度，即使阴性对照产生了正的信号，只要这些信号比实验样品的低得多，依据这样的结果，至少可以推测出实验中所得出的信号是真实的[4-6]。在一定程度上，荧光PCR消除了普通PCR过于敏感、假阳性率高的缺点。荧光PCR常用于研究发病机制、估计病毒的负荷量、监测临床治疗进展或用于诊断遗传缺陷等。通过对靶基因量的检测，将其与疾病的临床表现、临床分型以及各种标志酶的值联系起来，为疾病的诊断和物治疗监测提供科学的依据。目前，该技术已广泛应用于多种遗传病的诊断和产前筛查，如地中海贫血、儿童型脊肌萎缩症、杜氏/贝氏肌营养不良、胖骨肌萎缩症和各种染色体病等。
2 荧光PCR基因定位技术在遗传病诊断中的应用
2.1 在α地中海贫血中的诊断作用
1988年，Chehab用两对引物同时扩增α珠蛋白和β珠蛋白基因，并在这两对引物上分别标记上罗丹明和荧光素。在紫外线的照射下，罗丹明产生红色荧光而荧光素产生绿色荧光。在同一循环条件下PCR完成后，通过离心将扩增产物和游离引物分离，根据扩增后产物颜色直接判断基因的缺失情况[7]。如产物为桔红色，则说明α和β珠蛋白基因都得了扩增。如果产物为绿色，说明α珠蛋白基因缺失，只有显绿色荧光的β珠蛋白基因得到了扩增。
2.2 在DMD/BMD中的应用
DMD/BMD(杜氏/贝氏肌营养不良症)是最常见的致死性神经肌肉遗传病。在男性中，其患病率约为1/3 500，为x连锁隐性遗传，其中73%为缺失或重复突变，新生突变占所有患者的30%。由于x染色体的随机失活比例不同，约40%的DMD携带者不能通过血清CPKH活性诊断。1992年，schwartz将荧光PCR应用于该病的携带者诊断。他们采用荧光引物和测序仪分析位于肌营养不良基因内部的4对CA重复序列。测序仪可以鉴别2个碱基对长度的差异，能够为连锁分析提供更多的信息[8]。在以下情况时，连锁分析有时不足以对携带者进行判断：①CA重复不能提供信息，②家族成员不全，③新生突变或者嵌合体造成的连锁分析失效，因此，他们还采用荧光PCR直接扩增肌营养不良基因外显子，并用测序仪定量分析产物，将结果和连锁分析一起作为判断携带者的依据。通过以上方法，他们对43名可疑携带者进行了诊断。
2.3 在PGD的应用
植入前诊断(PGD)只能获得非常有限的模版，而荧光PCR比溴乙锭染色要敏感1 000倍，因此，荧光PCR在植入前诊断中的应用已经有较多的探索。等位基因失扩增(ADO)和污染是植入前诊断所面临的两个主要问题，因此PGD需要检测致病基因和连锁分析进行联合判断。但是限于取材，PGD只能提供一次PCR的模版。荧光PCR由于高灵敏度和分辨率，适合对少量模版进行多重PCR扩增，在一个体系中同时完成对疾病基因的检测和连锁分析。Joycec采用荧光多重PCR对6种遗传病：强直性肌营养不良(DM)、囊性纤维(CF)、脆性X综合征、神经纤维化2型和颅面成骨不全症进行了植入前诊断。在进行PCR的过程中都同时扩增了一个多态位点，以确定被扩增细胞的来源以及排除污染[9]。对于显性遗传病，多态位点还能够减少ADO可能带来的误诊。在他们进行的研究中，对14次妊娠进行的植入前诊断都得到明确结论，其中13例进行了胚胎移植，另有1例没有检测到正常胚胎。
总之，PCR技术在定量与定位领域中的应用已经逐渐由实验室中的探索发展成为理解复杂的生物本质的一项关键技术。毫无疑问，在不久的将来，荧光定量PCR技术将以其精确的定量，简单迅速的操作，合理的，在分子生物学、实验，特别是医学领域中得到更加广泛的应用。
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