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神经干细胞与脑梗死康复的研究现状
近年来的研究证实,成年中枢神经系统内广泛分布着神经干细胞(NSC)，海马齿状回颗粒下层和侧脑室下区是成体大脑内源性NSC存在的主要脑区。NSC正常情况下处于静息状态，当大脑受到损伤或出现某些病理性变化时会被激活，分化为成熟的神经细胞，修复受损的神经功能。可以通过某些手段(如康复训练、丰富环境、局部应用外源性神经生长因子)激活自身干细胞或移植干细胞(包括NSC移植和非NSC移植)脑梗死。
神经干细胞;脑梗死;丰富环境;移植
脑梗死是神经科最常见的疾患，尽管其诊断及治疗技术在过去的几十年中有了很大的提高，但治疗效果仍然不尽如人意。以往人们认为神经细胞是不可再生的，但多年来对神经营养因子( neuro tro phic factor , NTF) 及神经干细胞( neural stem cell, NSC) 的研究使人确信：包括人类在内的哺乳动物，在一定条件下神经细胞是可以再生的，新生的神经元可以修复中枢神经系统损伤。因此，NSC 治疗现已成为治疗神经系统疾病最有价值的潜在治疗手段。现将利用NSC治疗脑缺血的策略介绍如下：
NSC治疗脑缺血主要有两个途径：一是通过某些手段激活自身干细胞，放大其治疗作用，达到自身修复的目的；另一途径是移植NSC，这样可以获得大量的干细胞，但来源困难，且存在社会伦限制和免疫排斥反应。
1康复训练
在脑血管病患者发病早期进行及时、有效的康复训练是提高患者生活质量、减少残疾、最大限度回归社会的一个重要措施。李玲等的研究结果显示：大鼠脑梗死24h 后每日给予平衡、旋转、行走等功能训练，其神经功能的恢复较未进行康复训练的大鼠明显［1］，表明康复训练在脑梗死后神经功能的恢复中发挥极其重要的作用。王卫东等的研究显示：缺血性脑损伤后6至24 d 时间窗内，海马齿状回神经前体细胞的增殖水平明显上调，而脑梗死大鼠经康复训练后，齿状回神经前体细胞的增殖水平则进一步升高［2］。由于这些神经前体细胞绝大部分最终发育为成熟的神经元, 并移行到颗粒细胞层与周围的神经元进行整合，参与缺血性脑损伤后记忆功能的恢复［3］因此，缺血性脑损伤后进行康复训练所显示的神经功能恢复水平的提高，与包括海马齿状回在内的大脑多个部位的神经前体细胞增殖水平上调有关。周晓琳等的研究显示：局灶性脑缺血损伤后康复训练组在脑梗死后7 d、1 4 d 和21 d 各时间点海马区NSC 数量均高于相同时间点的未接受康复训练组，表明局灶性脑缺血损伤后，康复训练可以提高内源性NSC 的增殖水平［4］。局灶性脑缺血损伤后，康复训练可以提高内源性NSC 增殖水平，其机制还不清楚，可能通过以下几种途径促进缺血性脑损伤后齿状回神经前体细胞增殖：激发缺血性脑损伤后海马区神经生长因子、脑源性神经营养因子、转化生长因子、碱性成纤维生长因子等的释放；促进、诱导脑内DNA 的合成，激发细胞的有丝分裂；通过促进脑内血液循环，影响缺血性脑损伤后海马区兴奋性氨基酸受体、5羟色胺作用通路中谷氨酸和5羟色胺的代谢。
2 丰富环境( enriched env ir onment) 1947 年，美国人Hebb
提出丰富环境的概念，这一模式被广泛用来研究环境对脑功能的影响。已有研究证实，丰富环境对脑发育和脑损伤修复具有显著的促进作用。1978 年，丰富环境首次被定义为：复杂的无生命物与社会刺激的复合体，即动物的饲养环境空间增大，内置物体丰富而新奇，成员较多，不仅提供了多感官刺激和运动的机会，而且赋予了相互间社交行为的可能。尽管对丰富环境的具体设置各有差异，但总的原则是要增加自发的体力活动、社会性刺激及相互交往的机会［5］。研究表明，饲养于丰富环境的大鼠大脑皮质厚度、质量明显增加，神经元胞体和胞核面积增大，树突野增大，其侧棘增多，突触连接面变大，神经胶质细胞( 特别是少突胶质细胞) 的数量明显增多，且生活在丰富环境中时间越长、环境越丰富、个体之间交往越多，上述改变越明显， 受影响的皮质范围越大。丰富环境可以改善大脑中动脉梗死后成年大鼠的机能。丰富环境虽然对梗死面积没有影响，但可明显改善运动行为和认知能力［6］。Biernaskie 等的研究表明，在卒中后5 d 给予丰富环境是非常有效的，而且无论是卒中后14 d，还是卒中后30 d，接触丰富环境都能进一步促进神经功能的恢复［7］。Yasuhiko 等的研究表明，与假手术组相比，MCAO 诱发了同侧和对侧的齿状回神经前体细胞的先是短暂性增加后是持续性降低的增殖，而神经母细胞的产生一直处于一个低于基线的水平［8］。与标准环境的大鼠相比，处在丰富环境下8 周的MCAO 大鼠和假手术大鼠齿状回的神经元分化和神经发生出现了增加的现象。与假手术组大鼠相比，丰富环境组大鼠MCAO 后也在齿状回恢复了一定数量的神经母细胞。此外，丰富环境组大鼠缺血半暗带的神经蛋白( NeuN) 阳性细胞密度增加，而在这个区域没有发现新神经元。对于丰富环境的研究已经长达50 余年，丰富环境干预已经被证实是一种简便有效的治疗手段，对于延缓衰老、增进智力也有一定作用。不过仍然有很多问题没有解决，比如干预应该从什么时候开始，持续多久，何种干预最为安全有效，对于不同人群干预方式强度应该如何调整，过强的丰富环境刺激对机体有什么不利影响，如何避免这种不利影响。相信随着这些问题的解决，丰富环境干预将会成为被广泛接受的治疗手段。
3NGF
近年来，人们尝试在神经系统损伤局部应用某些激活因子, 以激活存在于损伤局部的NSC，诱导其分裂、增殖、分化为相应神经元或神经胶质细胞，重建、修复损伤的脑组织，扩充在卒中或其他神经疾病发病后用内源性NSC 治疗的可能性。脑室内注射BDNF［9］或脑室区BDNF 基因的过度表达可以使成年大鼠嗅球、纹状体、隔区、丘脑、下丘脑中的新生细胞数目增加。体外培养显示，骨髓间充质干细胞可表达BDNF和NGF，对NSC 凋亡有饱和作用。这些发现使BDNF在脑缺血后促进神经再生的可能性大大增加。但最近有相反的观点，Larsson 等发现，给全脑缺血大鼠的海马内转导携带BDNF基因的重组腺病毒，可促进神经细胞的分化，但未增加新生细胞的数目和延长新生细胞的生存时间。与SVZ 相比，成年的海马齿状回没有固有的NSC，却能使神经元和神经胶质细胞的前体细胞进行有限的自我更新，这与以上试验结果不完全一致。促红素( erythro poietin, EPO) 可能是调节缺血后神经细胞再生的另一个重要因子。EPO 产生是缺血 缺氧反应的一部分，同时， SVZ 可表达EPO 受体。脑室内注射EPO 可降低SVZ 中NSC 的数目，增加从SVZ 向嗅球迁移的新生神经元，增加嗅球的中间神经元；而脑室内注射EPO 抗体可增加SVZ 中NSC 的数目， 减少从SVZ向嗅球迁移的新生神经元。
这项研究结果表明，EPO 是自分泌旁分泌因子，能调节大脑NSC的产生。给梗死后2 d 或几周的成年小鼠脑室内注入EGF, 引起梗死侧纹状体新生细胞数目非常显著的增长, 梗死后13 周，65%的新生细胞表达细小白蛋白，表明EGF促进梗死侧纹状体内中间神经元的转换。Nakatomi 等的研究发现，在缺血性脑损伤后，向脑室内注入生长因子可促进内源性祖细胞的激活， 并观察到其增殖，随后迁移入海马重塑神经元，海马区锥体神经元显著增殖。进一步的研究显示，新生的神经元整合入脑的环路，改善了神经功能缺损的症状。
4干细胞移植
从胚胎和成年脑内分离出NSC，在体外培养扩增后移植入缺血周围区( 在体外采用血清预培养可使NSC聚球速度加快，促进NSC 增殖［10］)，利用其分化和迁徙特性，代替脑缺血后坏死的神经细胞，以恢复宿主中枢神经系统的正常结构和功能。1998 年，Brust le 将人胚NSC 移植入大鼠侧脑室，观察到移植细胞在轴突、神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等各个水平与宿主细胞广泛整合。王力平等的实验显示，移植的NSC 在小鼠脑脊液中存活良好，并具有向局部脑实质内迁移的能力。因此，可利用NSC 的生物学特性进行细胞替代和修复缺血所致细胞死亡引起的功能缺损。可能的干细胞移植手段包括NSC 移植和非NSC 移植，非NSC 移植主要指骨髓基质细胞( mar row stromal cell, M SC) 移植。Toda 等将NSC 移植入短暂性全脑缺血模型大鼠海马，发现有1% 3%的移植细胞存活，其中3% 9%的存活细胞表达神经元细胞核特异性抗原，即分化为神经元，改善了受损的空间认知能力( 通过水迷宫测试)。这表明NSC 移植入缺血大脑后能分化为神经元，并能改善空间认知能力。Kon 等将人类NSC 于大脑梗死后24 h 由静脉移植入大鼠体内，这些细胞结合到梗死灶周围，分化成神经元和星形胶质细胞，并存活到移植后56 d。这表明静脉注入人类NSC 可以结合到梗死灶，并且能在脑梗死急性期内对内源性有丝分裂信号产生应答，分化为成熟神经细胞，代替死亡细胞。因为获取大量的胚胎干细胞相对困难，研究人员开始将注意力转向异种胚胎干细胞移植，如猪胚胎干细胞。Dinsmor e 等发现，在鼠M CAO 后的第3、7、14、2 8 天，将105 个猪胚胎干细胞注入鼠的纹状体和顶叶皮质, 在移植后12 周，猪胚胎干细胞存活率超过80%，移植细胞转化为神经元及神经胶质细胞，MCAO 后第14 天，移植动物神经功能获得显著改善。MSC 是存在于骨髓中的非造血干细胞，又称间充质细胞，在适宜的条件下可以分化为神经细胞。Li 等将MSC 直接注入MCAO 大鼠纹状体内，28 d 后观察到MSC 成活并向缺血区迁移了2. 2 mm，与MCAO 而没有移植MSC 大鼠相比神经功能显著改善, 表明M SC 能在受体脑内成活并迁移，能参与MCAO 后神经功能的重建，表明MSC 移植可能是自体移植许多种神经系统疾病的一个非常有用的手段。另外，Shen 等在成年雄性大鼠脑梗死24 h 后，经颈内动脉注入2ml 106 个大鼠骨髓间质细胞或磷酸盐缓冲液, 28 d 后处死,发现骨髓间质细胞治疗组神经功能明显恢复。骨髓间质细胞治疗明显增强缺血半暗带皮质的血管发生,提高突触素表达和NG2 阳性细胞数目和密度,胼胝体的Ki67( 是反应肿瘤增殖的标记物,在许多肿瘤的研究中显示与预后有关) 阳性增殖细胞与少突胶质细胞的前体细胞也明显增加,并且增强胼胝体在两侧大脑半球的联系范围,这表明骨髓间质细胞能促进梗死大脑皮质边缘带与胼胝体的轴突芽殖和髓鞘再生,这可能是骨髓间质细胞治疗促进神经功能恢复的基础。但利用NCS 移植治疗脑梗死面临诸多问题,如目前建立的NSC 系绝大多数来源于鼠,而鼠与人之间存在着明显的种属差异;NSC 的来源不足; 移植后的NSC 存活比例及迁移能力都很低; 分化成神经元的比例也很低,功能神经不能形成; 不能精确控制移植细胞的迁徙和分化; 取材不易,靶点注射困难; 部分移植的NSC 成脑瘤; 利用胚胎干细胞代替NSC 存在着社会学及伦方面的问题等。
5问题与前景展望
脑梗死后,单纯外源性干细胞移植目的在于取代受损的神经组织,但利用NSC 移植治疗脑梗死面临诸多问题,因此其移植还不能普遍应用。而激活内源性NSC,在体内诱导内源性NSC 向神经元分化修补缺损的病灶,向少突胶质细胞分化重建髓鞘及其功能,这是目前较NSC 移植更具有临床意义的策略。因此,进一步阐明诱导内源性NSC 的分化机制,诱导内源性NSC 大量分化,增加其向病灶处迁移能力,调控它们向神经元和少突胶质细胞方向分化,并支持和引导轴突生长,在未来可能是治疗神经系统疾病的最有价值、简单易行的治疗方法。
［1］李玲, 徐莉, 晏培松, 等. 脑梗死大鼠康复训练后脑的增殖细胞核抗原的表达及病理学改变［ J］ . 中华物理医学与康复杂志, 2000, 22:339 342.
［2］ 王卫东, 王洪典, 王津存, 等. 康复训练对成年大鼠脑梗死后海马齿状回神经前体细胞增殖的影响［ J ］ . 中华物理医学与康复杂志,2003, 25: 386 389.
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［11］ 王力平, 樊东升, 王荫华, 等. 神经干细胞脑脊液移植后存活及迁移研究［ J］ . 中国康复理论与实践, 2005, 11( 5) : 337 338
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