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体内损伤构建椎间盘退变动物模型的研究进展
【摘 要】 按照构建椎间盘退变动物模型时的损伤方式对体内构建退变椎间盘动物模型的方法进行综述。体内构建椎间盘退变动物模型的方法很多，但各有优缺点，在以后的实验过程中进一步研究和建立综合模型仍然是努力的目标。
【关键词】 椎间盘;动物模型;体内损伤;综述
近年来，随着人们生活和工作习惯的改变，椎间盘退变性疾病(disc degeneration disease，DDD)已成为现代人群中常见的疾病。本病是造成颈、肩、腰、腿痛的主要原因，严重影响了人们的生活和工作，甚至有些患者因出现严重的神经损伤症状而不得不行手术治疗，给患者带来巨大的精神和经济负担。为了更好地探索本病的发生机制及治疗方法，20多年前，人们开始运用具有与人类椎间盘高度相似性的动物退变椎间盘来研究本病的病因病机，寻找更好的治疗方法。近几年，用于构建动物模型的种类和造模的方法主要分为2大类型：体内损伤动物模型和体外动物模型。体内损伤动物模型主要指通过干预、诱导动物椎间盘退变，依据其在影像学、形态学和生物化学等方面的变化，动态观察动物椎间盘退变的病理过程。体外动物模型是指在体外培养的细胞和器官模型，此模型多用于短期的实验观察，实验结果论证能力弱。笔者通过查阅近十年来大量的国内外文献，总结了在动物体内构建椎间盘退变模型的方法，并分析每种方法的优缺点。
1 动物的选择
从开始使用动物构建椎间盘退变模型到现在，研究者尝试了各种各样的动物，总结出用于构建椎间盘退变模型的动物应符合如下几个条件[1]：
①所用动物脊柱的解剖特点、生物力学特性、生理、病理功能等应与人类高度相似;②所选动物可客观地重复椎间盘退变的病理过程;③所构建的动物模型具有可复制性;④动物价格较为便宜，且较易饲养，种群数量较多。目前，很多小型哺乳动物及啮齿类动物被学者作为动物模型;但是由于某些伦理因素[2]，现如今大多数学者采用鼠及兔作为建模动物[3]。
2 构建椎间盘退变模型
2.1 生物力学模型(biomechanical model，BM) Goff等[4]运用手术方式培训大鼠，改变其爬行习惯使其靠双后肢如人类直立行走，从而使大鼠的椎间盘发生退变，他也是首个通过改变大鼠行走习惯来构建椎间盘退变动物模型的学者。本造模方法简单经济、成功率高、重复性好，建立的双后肢大鼠模型符合人体椎间盘退变规律;但是其与伦理道德相悖，多数学者不赞成用此种方法建模。张超等[5]将兔子固定在PVC管中，并将PVC管直立，使兔子腰椎受力负荷增加，8周后发现兔子的脊柱高度发生明显降低，椎间盘发生明显退化，这说明了通过强迫直立位下，因自身身体重力负荷对椎间盘产生影响可以成功建立椎间盘退变模型。Barbir等[6]将大鼠尾巴固定在U型架上，在一段时间后发现尾椎椎间盘出现退变，证实椎间盘退变的程度与应力改变有关。熊晓芊等[7]通过轴向加压构建兔子椎间盘退变模型发现，通过轴向加压可使兔子腰椎间盘发生明显退化。
BM对实验动物损伤较微小，具有操作简便、经济、效果可靠等优点。在诱发轻度椎间盘退变模型时见效快，造模的效率较高，通过该方式建模，椎间盘的结构及基质的改变与人体椎间盘退变的过程大致相似，可满足基因治疗时需要长期观察疗效的实验研究的需要。
2.2 机械损伤模型(mechanical damage model，MDM)
指运用各种方式破坏动物的椎间盘纤维环、髓核、终板或通过手术破坏棘上、棘间韧带、椎旁肌肉和棘突等改变造模动物脊柱的力学分布，改变椎间盘内环境，从而获得椎间盘退变动物模型。
2.2.1 纤维环损伤模型 通过针刺、刀片切割等方法，直接造成纤维环的物理损伤。Osti等[8]是较早用该方法构建动物椎间盘退变模型的学者，其通过手术方式切除羊的部分纤维环，4个月后发现羊的椎间盘发生了明显的退变。Wang等[9]运用21号针头针刺破坏大鼠纤维环，在数周后发现其椎间盘发生了明显退变。崔运能等[10]在CT引导下，用18 G穿刺针经侧方皮下穿刺兔L5～6椎间盘，确认刺入椎间盘纤维环深度约为5 mm，在84 d后，实验组影像学上见兔的椎间盘高度下降，终板骨质硬化;组织学上见纤维环结构紊乱、髓核细胞轻度减少。崔力扬等[11]用21号针头针刺大鼠全层纤维环和部分纤维环，4周后大鼠椎间盘在影像学上发生明显变性，而部分大鼠在8周后才可见到此现象。
通过针刺损伤纤维环构建椎间盘退变模型时，其退变的过程较为缓慢，退变的程度与损伤的大小之间存在明显的正相关性，此为一较为缓慢推进的过程，可较充分地再现椎间盘退变的发展规律，与人类椎间盘退变病理变化过程较为相似，且造模过程简单，易重复，故可以作为椎间盘退变研究的动物模型。但需要精确地把握穿刺时所选的穿刺针的型号及进针的位置和针刺的深度，且手术过程中常需采用腹部或者其他手术切口，创伤大，易造成腹膜及腹腔脏器的损伤，极大地伤害了造模动物，增加感染的机率，较难保证造模动物的存活率。
2.2.2 髓核损伤模型 该方法主要是通过穿刺、抽吸模型动物脊柱椎间盘髓核，造成髓核退变，从而引发模型动物椎间盘退变。陈国仙等[12]通过模拟人后路髓核摘除构建大鼠椎间盘退变动物模型，培养8周后发现大鼠椎间盘的髓核细胞明显减少，纤维环结构发生明显改变。Liu等[13]在磁共振引导下，用16号穿刺针经皮穿刺抽吸白兔椎间盘部分髓核，造成白兔髓核损伤诱导椎间盘退变模型。
通过针刺损伤动物椎间盘髓核构建椎间盘退变模型具有创伤小、剂量麻醉少、损伤小、动物模型存活率较高、操作时间短等优点，而且通过此方法构建的模型出现椎间盘退变的时间较早，进程较快，程度较重，故可以作为椎间盘退变研究的动物模型。同时它也存在着较难确定皮肤手术进针点，易损伤脊神经及容易形成椎体旁骨赘等不足，要求操作者有较高的技术及较丰富的经验。如果可以在影像透视指导下行刺，将会更加符合当今世界上倡导的微创趋势。
2.2.3 终板损伤模型 在成人中，髓核细胞的营养主要来自软骨终板的渗透作用，所以当软骨终板结构发生改变时，便直接影响髓核细胞的代谢，同时由于椎间盘内部力学特性的改变，椎间盘形态可发生改变，造成椎间盘退变。该方法操作过程为：经过模型动物的椎体钻1个斜行的空洞，直达软骨终板，形成急性终板损伤引起髓核压力降低和应力重新分布，从而导致椎间盘退变。操作时需注意掌握深度，不要贯穿上下终板。Yuan等[14]通过破坏猪的椎体终板，9周后发现家猪的椎间盘内环境发生明显的改变，椎间盘炎症介质明显增多，纤维环发生明显的破坏性改变。
终板下方有着丰富血供的骨质，含有数量巨大的免疫细胞，因此，通过损伤终板来构建椎间盘退变模型，其退变的速率比纤维损伤等方法发生更快，进展更迅速，且其退变的程度也更加严重，为一种快速腰椎退变的动物模型，可以用来研究人类椎间盘退变的病理、生理及形态学变化。它也存在着定位难、容易形成骨赘等不足。
2.2.4 椎旁的结构损伤模型 该方法主要是通过手术破坏模型动物的脊柱支持组织或椎体、椎间关节融合等手段可使脊柱过度运动，造成脊柱失稳、造成椎间盘受力不平衡，而导致椎间盘退变。Zhou等[15]通过切断大鼠颈部部分，造成颈部力学失衡，从而导致大鼠椎间盘纤维环明显被破坏。
Woiciechowsky等[16]对小鼠行脊柱融合术，在3个月后发现小鼠纤维环部分变性。
该方法并未直接人工干预损伤动物模型的椎间盘，保持了动物椎间盘的完整性，与人类椎间盘自然退变的过程较为相似，可作为短期研究人类椎间盘退变的动物模型。该方法有对动物损害较大，且手术并发症较多，易造成造模动物存活率低等缺点。
2.3 化学损伤模型(chemical damage model，CDM)
使用药物注射构建椎间盘退变动物模型是最近几年来新的发展趋势，并有了较大的进展。该方法主要是在尽量少损坏模型动物椎间盘纤维环、终板及脊柱周围力学结构的前提下，将某些化学药品注射到椎间盘髓核内，造成髓核溶解，引起椎间盘退变。从大量的文献报道中可以发现，主要是向动物椎间盘内注入酶类物质，例如木瓜凝乳蛋白酶(chymopapain)或纤维结合蛋白(binding protein fiber，BPF)，从而使髓核细胞发生变性、死亡，蛋白多糖(proteoglycan)的急剧降低，造成椎间盘的退变。近年来，也有学者通过切除动物的子宫，改变动物体内激素水平，从而加速椎间盘的退变，构建椎间盘退变动物模型。Zhan等[17]在X线透视下，向髓核内注入1 mg BPF，3周后X线片显示椎间盘脱水变薄，磁共振可见T2像信号强度减弱，提示椎间盘退变。Furtw ngler等[18]把牛尾椎间盘置于蛋白水解酶(proteolytic enzymes，PE)混合物的培养基中3周，发现椎间盘中央区变性、糖胺聚糖(sugar glycosaminoglycans，SG)含量下降。王娜等[19]将纤连蛋白片段注入大白兔的椎间盘中心区域，10周时观察到髓核细胞数量明显减少，细胞变圆，呈明显的成簇聚集分布，纤维环排列明显的不规整，各层间出现裂隙，甚至断裂，蛋白聚糖染色明显变浅，甚至部分未见染色，椎间盘发生明显退变。Woiciechowsky等[16]通过多年的跟踪和检测发现，妇女在绝经后其椎间盘的退变速度明显加快。
化学损伤诱导兔椎间盘退变模型与人类椎间盘退变的过程更相似，生物化学特质更接近，模型可重复性强，退变周期较长，适用于分子水平研究椎间盘退变的动物模型。同时它也具有退变发生快，对造模动物损害大，成本高，难通过调节注射剂量来调控退变程度等缺点。
2.4 手术植入模型 通过手术方式，植入介质，从而压迫脊髓、神经，构建椎间盘退变模型。这种方法多用来构建椎间盘突出、脱出或者是椎管内占位的动物模型。王雪乔等[20]通过半椎板切除术，暴露L1脊髓，并置入球囊，构建腰椎间盘突出症状。
3 结 语
综上所述，体内损伤构建椎间盘退变模型常用的方法均有各自的优缺点，在实际的造模过程中，应该根据具体的实验情况及实验室条件选择较为合适的造模方法。但是无论采取哪一种方法，比较理想的椎间盘退变动物模型要求跟人类的椎间盘退变的过程具有可比性、相似性，所选择的实验动物应遵循“3R”原则，同时也应具有经济、简单、来源充足的特点，应当设计及构建临床实用性强的椎间盘退变模型。需要借助现代医疗科学技术，不断探索何种条件建立安全、有效、与人体真实情况相似、容易重复获得的椎间盘退变动物模型。
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