谈黄芪和三七有效成分对脑缺血再灌注后细胞凋亡的影响论文
脑缺血再灌注损伤( Cerebral ischemia-reperfusioninjury，CIR) 是指缺血脑组织在恢复血液灌注后，脑组织损伤进一步加重的现象。脑缺血后神经细胞的损伤形式可分为急性损伤和迟发性损伤，而细胞凋亡是导致迟发性损伤的主要病理机制。细胞凋亡是细胞在相关基因的控制下进行的自主的程序化的死亡过程。在凋亡过程中，半胱氨酰天冬氨酸蛋白酶( cysteine aspartic acid specific protease，caspase) ，起到重要的调控作用。caspase-3 是caspase 家族中重要成员之一，是细胞凋亡过程中最主要的终末效应部分，是细胞凋亡的必经之路，故caspase-3 表达上调可作为细胞凋亡的标志。
依达拉奉是一种脑保护剂，其主要作用是清除自由基，抑制脂质过氧化，保护脑、血管内皮和神经细胞避免氧化损伤，临床上主要用于治疗脑梗死，具有确切的临床疗效。近年来有研究表明，依达拉奉可明显减少急性脑缺血再灌注大鼠脑神经细胞凋亡数，故选择其作为本研究的阳性对照药。
中医认为气虚血瘀是缺血性中风的主要病理机制，故可用益气活血法进行治疗。黄芪是常用的益气药，三七是常用的活血药，二者配伍，符合益气活血的治疗原则。中药药化研究发现，黄芪中具有抗脑缺血作用的主要有效成分为黄芪甲苷( 以下简称ASTⅣ) ; 三七中具有抗脑缺血作用的主要有效成分包括人参皂苷Rb1( 以下简称Rb1) 、人参皂苷Rg1( 以下简称Rg1) 和三七皂苷R1( 以下简称R1)。本研究从脑缺血再灌注后神经细胞凋亡方面探讨黄芪和三七有效成分配伍抗脑缺血的作用机制，探索黄芪和三七有效成分配伍的组方规律，寻找其抗脑缺血的有效配伍组合，为黄芪和三七的进一步合理开发应用提供科学的实验依据。
1 材料与方法
1. 1 实验药物与试剂
三七皂苷R1 对照品( 批号: 12051001，规格:20 mg /支) 、黄芪甲苷对照品( 批号: 12061101，规格:20 mg /支) 、人参皂苷Rb1 对照品( 批号: 12051001，规格: 20 mg /支) 、人参皂苷Rg1 对照品( 批号:12052401，规格: 20 mg /支) ，以上药品均由成都曼思特生物科技有限公司提供。依达拉奉( 批号: 80-090711，规格: 10 mg /支) ，由南京先声东元制药有限公司提供，给药时用0. 9%氯化钠稀释，配成0. 4 mg /mL 溶液。蛋白质抽提试剂盒( 产品货号: KeyGEN，由南京凯基生物科技发展有限公司提供) 、BCA 蛋白质定量试剂盒( 产品货号: AR0146，由武汉博士德生物工程有限公司提供提供) 、细胞凋亡检测试剂盒Ⅲ( FITC)( 产品货号: MK1023，由武汉博士德生物工程有限公司提供) 、磷酸酶抑制剂复合物Ⅲ ( 产品货号:C500019-0001，由上海生工生物工程股份有限公司提供) ; 兔抗小鼠Caspase-3 抗体( 批号: SC7148，购自Santa Gruz Biotechnology) ，兔抗小鼠β-actin 抗体( 批号: sc-130656，购自Santa Gruz Biotechnology) ，均4℃保存; HRP-Goat Anti-Rabbit Ig ( H + L ) ( 批号:SA00001-2，购自Proteintech Group) ，- 20 ℃保存。
1. 2 动物、分组及给药方法
88 只SPF 级C57BL /6 小鼠，雄性，体重20 ～25g。饲养于SPF 级动物实验室，相对湿度40% ～60%、温度20 ～ 26 ℃。根据前期实验结果[9]，随机分为以下11 组: 1. 假手术组，2. 模型组，3. 黄芪甲苷组，4. Rg1 组，5. Rb1 组，6. R1 组，7. 四种有效成分配伍组，8. 黄芪甲苷+ Rg1 组，9. 黄芪甲苷+ Rb1 组，10.黄芪甲苷+ R1 组，11. 阳性对照药依达拉奉组。各组给药剂量: 1、2 组0. 5%羧甲基纤维素钠10 mL /kg; 3组AST Ⅳ40 mg /kg; 4 组Rg1 50 mg /kg; 5 组Rb1 40mg /kg; 6 组R1 10 mg /kg; 7 组AST Ⅳ和Rb1 各40mg /kg，Rg1 50 mg /kg，R1 10 mg /kg; 8 组AST 40 mg /kg，Rg1 50 mg /kg; 9 组AST Ⅳ和Rb1 各40 mg /kg; 10组AST 40 mg /kg，R1 10 mg /kg; 11 组依达拉奉4 mg /kg。第1 - 10 组均灌胃给药，1次/d; 第11 组腹腔注射给药，2次/d。连续给药3 d，末次给药1 h后进行造模。
1. 3 脑缺血模型制作
乙醚麻醉小鼠，仰卧位固定，颈部手术，用动脉夹夹闭颈总动脉20 min，造成脑缺血。假手术组也进行颈部手术，但不夹闭双侧颈总动脉。再灌注24 h 后，将小鼠迅速断头，取出脑组织做相应指标检测。
1. 4 神经元凋亡检测
取视交叉后脑组织，固定、脱水、石蜡包埋，作冠状切片，厚度约为7 μm，TUNEL 法测定神经细胞凋亡，计算凋亡率( %) 。
1. 5 caspase-3 蛋白表达检测
取视交叉前脑组织，裂解、离心。采用BCA 法进行蛋白质定量，并计算含110μg 蛋白的裂解液容积作为上样量。western-blot 法检测caspase-3 蛋白和内参照蛋白β-actin 的表达。用Image-Pro Plus 6. 0 图像分析软件测定caspase-3 和内参蛋白( β-actin) 的累积光密度值( IOD) ，并以两者IOD 的比值作为caspase-3 的相对表达量。
1. 6 统计分析方法
实验数据采运用SPSS16. 0 统计软件进行统计分析。各组均数采用单因素方差分析，方差齐者用最小显著性差异法检验。P < 0. 05 为有统计学意义。
2 结果
2. 1 各组神经元凋亡率
各组神经元凋亡率的比较见图1。与假手术组比较，模型组凋亡率显著升高( P < 0. 01) 。与模型组比较，各给药组凋亡率显著降低( 均P < 0. 01) 。ASTⅣ + Rg1 组与AST Ⅳ + R1 组降低凋亡率的效应分别大于各有效成分单用组( 均P < 0. 01) 。四种有效成分配伍组降低凋亡率的效应大于四种有效成分单用组及AST Ⅳ + Rb1 组( 均P < 0. 01) ，与阳性对照药依达拉奉组、AST Ⅳ + R1 组、AST Ⅳ + Rg1 组比较，差异无统计学意义( 均P > 0. 05) 。2. 2 各组脑组织caspase-3 蛋白表达各组脑组织caspase-3 蛋白表达的比较见图2。与假手术组比较: ◇P < 0. 05，◇◇ P < 0. 01; 与模型组比较:△P < 0. 05，△△P < 0. 01; 与AST Ⅳ组比较: * P < 0. 05，** P<0. 01; 与Rg1 组比较: □P < 0. 05，□□ P < 0. 01; 与Rb1 组比较: P < 0. 05，P < 0. 01; 与R1 组比较: ☆ P < 0. 05，☆☆ P <0. 01; 与四种有效成分配伍组比较:P < 0. 05，P < 0. 01a. caspase-3 蛋白表达的western-bloting 图谱; b. caspase-3 蛋白表达的比较图2 各组脑组织caspase-3 蛋白表达的比较( 珔x ± s，n = 8) 与假手术组比较，模型组caspase-3 表达显著升高( P < 0. 01) 。与模型组比较，各给药组caspase-3 表达显著下降( 均P < 0. 01) 。AST Ⅳ + Rg1 组与ASTⅣ + R1 组降低caspase-3 表达的效应分别大于各有效成分单用组( P < 0. 01 或P < 0. 05) 。四种有效成分配伍组降低caspase-3 表达的效应大于各有效成分单用组、AST Ⅳ + R1 组及AST Ⅳ + Rb1 组( P < 0. 01或P < 0. 05) ，与阳性对照药依达拉奉组、AST Ⅳ +Rg1 组比较，差异无统计学意义( 均P >0. 05) 。
3 讨论
本研究结果显示，对小鼠进行脑缺血再灌注处理后，其脑组织发生细胞凋亡，caspase-3 蛋白表达增加。黄芪与三七的各种有效成分单用及配伍均可减轻缺血再灌注后神经细胞的凋亡，降低凋亡率，减少caspase-3 蛋白的表达。AST Ⅳ + Rg1 与AST Ⅳ + R1降低凋亡率和减少caspase-3 蛋白表达的效应分别大于各药物单用，表明黄芪甲苷与人参皂苷Rg1 或三七皂苷R1 配伍对神经细胞凋亡的抑制作用增强，可能具有协同增效作用。四种有效成分配伍降低凋亡率的效应大于四种有效成分单用及AST Ⅳ + Rb1，减少caspase-3 蛋白表达的效应大于四种有效成分单用及AST Ⅳ + Rb1 和AST Ⅳ + R1，表明四种有效成分配伍能增强抗细胞凋亡的效应。以上分析结果提示黄芪甲苷与三七的有效成分可以抑制脑缺血再灌注后神经细胞凋亡的发生，黄芪甲苷与人参皂苷Rg1配伍、黄芪甲苷与三七皂R1 配伍以及四种有效成分配伍对细胞凋亡的抑制作用增强。
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