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细胞凋亡与女性生殖研究进展
关键字： 细胞凋亡 生殖细胞凋亡，亦称程序性死亡，是进化上细胞自杀的保守性程序，它对调节细胞自然丢失和组织自身平衡有着重要作用。现已证实，从细菌、无脊椎动物、脊椎动物一直到人，细胞凋亡现象普遍存在。凋亡细胞的典型特征为：染色质固缩；基因组脱氧核糖核酸（DNA）降解，形成单个或多个核小体的片断，在含溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳上呈典型“梯状”条带；凋亡小体的形成。凋亡小体和“梯状”条带已成为鉴定凋亡细胞的主要实验手段。最近几年，对细胞凋亡机制的研究已取得很大进展，本文对女性生殖过程中细胞凋亡的研究作一综述。
一、卵巢颗粒细胞的凋亡
卵巢为一动态组织，在每个月经周期中许多卵巢开始发育，但仅一个或两个卵泡占优势而排卵。在卵泡闭锁期间，大多数卵泡死亡，这些生理活动可能与细胞凋亡有关。有关卵巢颗粒细胞（ranulosa cells’GCs）凋亡的研究已十分深入。现已证实，多种基因参与了细胞凋亡[1~3]。其中，Bax、p53、WT-1(wilm’s tunor type1)、Fas、Bcl-XShort等基因有促进细胞凋亡的作用，而Bcl-2、Bcl-Xlong等基因起抑制细胞凋亡的作用，且它们的作用皆受促性腺激素中促黄体生成激素（LH）和促卵泡成熟激素（FSH）的调控。促性腺激素分别通过抑制GCs凋亡。而促性腺激素释放激素（GnRH）及其激动剂（GnRHa）以及睾酮（T）却对GCs凋亡起诱导作用。提示人GCs凋亡主要受体液因素的调节。
除了基因水平的调节外，GCs凋亡的细胞内机制可能与caspases凋亡途径有关。caspases为一半胱氨酸蛋白酶家族，它对底物中天冬氨酸有特异性，它的活化是底物内部天冬氨酸残基断裂所必须的。编码caspases的基因与线虫遗传学中定性的凋亡基因具有同源性。已显示，在小鼠和母牛GCs和黄体细胞中caspase-1和caspase-3表达。最近，Lzawa等[4]用逆转录多聚合酶链反应（RT-PCR）证实了人GCs中caspase-1、caspase-3、凋亡相关蛋白酶激活因子-1、DNA断裂因子等基因转录物的存在，同时用Western印迹证实了caspase-1、caspase-3蛋白前体的存在。体外非细胞系系统研究也提示，凋亡相关蛋白酶激活因子-1、caspase-3及DNA断裂因子是一活化的凋亡级联反应的组分，其能导致凋亡细胞基因组DNA的特异性降解。人GCs可能也同样存在着凋亡相关蛋白本科激活因子-1激活caspase-3，从而依次活化DNA断裂因子以诱导基因组DNA断裂的凋亡机制。另外，不同caspases家族成员的存在，也提示GCs中可能存在caspases不同成员之间的连续活化，如：caspase-9激活caspase-3，再依次激活caspase-6，导致细胞骨架和核纤层降解，从而引起细胞凋亡的机制。
GCs的凋亡亦受类胰岛素生长因子（IGF）、类胰岛素生长因子结合蛋白（IGFBP）、IGFBP蛋白酶、激活素（activin）、及γ-干扰素（IFNγ）等协调调控[5]。卵巢膜细胞可产生IGF-I，GCs-II，产生的IGF可成为卵泡液的成分。IGF有促进卵巢细胞有丝分裂和分化的功能，并能抑制GCs凋亡。IGF对卵巢的作用能被IGFBPs家族成员所拮抗，IGFBPs家族共有6个成员，除IGFBP-6外其余5种IGFBPs信使核糖核酸（mRNA）均在黄体化GCs中表达，并产生除IGFBP-5外的所有蛋白。促性腺激素可刺激IGF的产生，降低IGFBP-2和IGFBP-4的水平，从而GCs的凋亡；而IGFBPs的作用与促性腺激素和IGF的作用相反，可促进GCs的凋亡。
有人卵巢的排卵前卵泡和黄体中，淋巴细胞和巨噬细胞可产生IFNγ进入卵泡液中。在培养的GCs中加入IFNγ，GCs中IGFBP-2和IGFBP-4水平明显增加，GCs凋亡指数亦上升。GCs亦产生激活素，它是一种二聚体蛋白。激活素A为一种βA亚单位的同源二聚体，它可促进啮齿动物GCs的凋亡。激活素A加入培养的GCs中，同样可增加IGFBP-4水平。IFNγ和激活素A增加IGFBP水平时，相应的mRNA水平并无明显变化，提示它们可能都是通过抑制相应的IGFBP蛋白酶而使IGFBP水平升高的，因为它们皆能抑制类固醇激素，如：雌激素（E）和孕激素（P）的产生，而E的存在可促进IGFBP-4蛋白酶的产生。IFNγ的作用受LH的拮抗，而激活素A的作用不受LH的直接影响，而受LH刺激的GCs产生的卵泡抑素（follistatin）抑制，卵泡抑素能中和活化素结合蛋白。另外，IFNγ还能诱导Fas抗原表达，而不论在健康还是闭锁卵泡的卵母细胞上均Fas抗原配体的表达[2]，提示卵母细胞具有诱导表达Fas抗原的GCs凋亡的能力。EGF、BFGF、GH有与IGF类似的作用，但它们是否通过与IGF类似的调节机制调控GCs凋亡，尚待进一步证实。
最近有证据提示，凋亡细胞内部启动一共同的信号途径，即通过活化鞘磷脂酶，水解鞘磷脂成酰基鞘氨醇，其作为第二信使依次启动细胞凋亡。但此过程在GCs中尚未被证实。
排卵前的卵泡GCs可分为两组，它们的凋亡特征有所不同。一组是卵泡壁GCs，含较高的LH受体，能分泌较高浓度的P，分泌的P对胚植入子宫内膜有重要作用。另一组是卵泡卵丘细胞，为GCs的一个亚群，它对卵母细胞的营养和成熟有重要作用，并且可调节输卵管收缩，排卵后，卵丘细胞对维持卵母细胞生存，直至与精子结合提供环境。研究证实[6，7]，卵泡壁GCs的凋亡发生率明显高于卵丘细胞，这对保持卵母细胞处于健康状态是相当合理和重要的。另外，卵泡发育的不同时期的GCs发生凋亡的敏感程度亦不同，Johnson等[3]认为，4~8mm的卵泡GCs最易发生凋亡而致卵泡闭锁，此期的GCs几乎检测不到凋亡抑制基因表达的产物。
除卵泡GCs外，黄体化GCs亦发生凋亡，它与黄体退化密切相关[8]。在月经周期的14~16d，黄体分泌P，若一个生殖周期内未发生妊娠，则黄体必须退化以保证下一个生殖周期的排卵卵泡的发育，而黄体退化机制与GCs凋亡机制类似。若发生妊娠，则P的存在及人绒毛膜促性腺激素（hCG）的分泌可抑制细胞凋亡，从而抑制黄体的退化。妊娠早期的黄体是维持妊娠所必须的。
二、子宫内膜细胞的凋亡
在月经周期中，子宫内膜呈周期性变化，由增生期、分泌期和月经期组成。在分泌晚期和月经期子宫内膜功能层细胞剥脱去除，随后在增生期基底层细胞又不断增生补充，而且月经期获得的子宫内膜丝状物中并没有任何广泛的坏死物。子宫内膜这种周期性变化是否与凋亡有关，有不少作者进行了研究。Kokawa等[9]用末端标记法和原位杂交技术检测了有规律月经周期女性的子宫内膜细胞的凋亡情况，在增生早期子宫内膜腺细胞有少许低分子量DNA，增生后期及分泌早中期未检测到低分子量DNA，而分泌晚期的初期又重新出现凋亡子宫内膜细胞并迅速扩展到整个功能层，月经期残余的功能层中凋亡细胞含量最高，而在整个月经周期中基底层细胞都未显示凋亡。Tabibzadeh等[11]亦报道，分泌晚期及月经期子宫内膜功能层细胞凋亡小体和DNA“梯状”条带明显增加，从而证实了凋亡在调节女性月经周期中确实起作用，并且周期性凋亡主要发生于功能层。
已有文献报道[10]，正常子宫内膜细胞在增生早期至分泌中期都表达Bcl-2基因产物，而在分泌晚期Bcl-2的表达消失；相应地，在增生期时Bcl-2蛋白在基底层占优势，并渐渐扩展到功能层的顶端，而分泌后期消失。Tabibzadeh等的报道支持了这一点，并进一步证明，在整个月经周期中正常子宫内膜连续表达Fas抗原和TNF受体。Liu等[1]用RT-PCR法亦检测出子宫内膜基细胞中，有p53、Bax、Fas基因的表达，而且，最近亦有文献报道，caspase-1与子宫内膜细胞凋亡有关。结合子宫内膜月经周期中E和P的周期性变化，即在分泌后期E和P迅速降低，推测子宫内膜功能层细胞与GCs类似，在E和P启动下调控各种凋亡相关基因的表达，使子宫内膜呈周期性变化。三、子宫内膜异位症和细胞凋亡的关系
正常情况下，子宫内膜组织仅限制于子宫内膜，若其植入机体其它部位并生长，即称为子宫内膜异位症（endometriosis’ET）。它是一种妇科常见病，发病率占育龄妇女的10%~15%。目前多用逆行月经、淋巴扩散、化生及胎性剩余等概念来解释ET的发生机制，并且ET的发生与免疫系统异常有关，异位组织可抵抗单核细胞和巨噬细胞介导的细胞毒性。尽管这可部分解释为什么异位组织可长期在异位部位生长，但关于异位组织的异常存活是否与调亡抑制有关，直到最近才有报道。Gebel等[11’12]用ELISA法检测了16例ET患者和10例对照者正常位和异位子宫内膜组织自发凋亡率。结果正常者子宫内膜组织自发凋亡率为1.43±0.11（吸光率），而ET患者的正常位和异位子宫内膜组织的自发凋亡率分别为0.63±0.1和0.26±0.06，自发凋亡率明显降低，且这种降低与月经周期无关，并随着ET严重程度增加而进一步降低。提示ET患者子宫内膜组织对凋亡的抵抗性可能是ET发生的原因之一。
最近，Watanabe等[11]报道，ET患者的正常位和异位子宫内膜组织皆能表达Fas和Bcl-2。Sbracia等[13]的进一步研究表明，ET患者的正常位子宫内膜在增生期Bcl-2蛋白阳性率高，而Fas抗原降低；到黄体期后，Bcl-2阳性率降低，而Fas阳性率增加。但在异位子宫内膜组织仅Bcl-2阳性，而Fas抗原阴性。这进一步证实了异位子宫内膜组织凋亡敏感性降低。然而，Tao等[10]却报道，ET患者的正常位和异位子宫内膜组织皆比正常者的子宫内膜组织表达更高的Bas、Bak及Bcl-Xlong，而仅在腺上皮和少许基细胞表达Bcl-2。Bax、Bak及Bcl-Xlong皆可促进细胞凋亡。这种不一致的结果是否说明ET患者的组织有不同的凋亡方式，尚无定论。ET患者子宫内膜组织自发凋亡的降低是否由于这些组织的细胞不能表达与启动凋亡有关的表面受体，或者凋亡信号不能正确传导，这还需进一步研究。
ET患者可致不孕已众所周知。子宫内膜异位组织最常见于卵巢，严重者可出现巧克力囊肿，并引起盆腔器官的广泛粘连。研究表明[14，15]，ET患者卵巢泡的壁GCs和卵丘细胞的凋亡小体发生率皆比正常者明显升高，且随ET严重程度增加而增加，有巧克力囊肿者比无巧克力囊肿者的GCs的凋亡小体发生率高。而且，在体外受精（IVF）中的ET患者的卵母细胞俘获数及成熟卵母细胞数皆降低。用ET患者的卵进行体外受精-胚移植（IVF-ET），胚胎的植入率降低，其妊娠率也相应降低。这可能与ET患者的卵母细胞质量降低有关。卵丘细胞凋亡率的增高，可影响卵母细胞的正常发育；而壁GCs和卵丘细胞凋亡的增加皆可致卵泡闭锁，导致成熟卵母细胞数降低。两者皆可导致ET患者生育力的降低。
四、体外受精-胚胎移植中的细胞凋亡
IVF-ET已被广泛用于治疗不明原因性不孕、输卵管性不孕、男性因素的不育以及ET患者的不孕。Nakahara等[6，7]在患者基础上和个别卵泡基础上都证实，在IVF-ET中，非妊娠者所用的卵泡的壁GCs的凋亡小体发生率明显高于妊娠患者，提示卵泡壁GCs中凋亡小体的发生率可被作为IVF-ET成功的指标。但他们的研究同时证实，妊娠者与非妊娠者相比，前者的卵母细胞俘获数、成熟卵母细胞数及子宫内膜厚度均比后者高，而且Fujino等[16]对鼠的研究显示，年龄对卵母细胞数量亦有深刻影响。提示，单纯以GCs的凋亡率来预示IVF-ET的结果是不充分的，它可能只是影响IVF-ET成功的一个因素。
最近，Moreira等[17]又在单个卵巢基础上研究了卵巢壁GCs凋亡率与卵巢生殖力之间的关系。研究显示，尽管右侧卵巢俘获卵母细胞数稍高于左侧卵巢，但两侧卵巢的壁GCs凋亡率并没有明显不同。他们又根据左右两侧卵巢俘获卵母细胞总数将患者分为两组进行比较，结果俘获卵母细胞总数在8个以上者比小于7个的患者有显著低的GCs凋亡率。此结果进一步提示，在IVF-ET中，单个卵泡的质量低下，引起了患者总体生殖力的降低。
在IVF-ET中，常可见到一些胚胎中有碎片，或有些胚胎停止发育，它们可能与凋亡有关。Stachecki等[19]的研究证实了这一点，他们认为胚胎的停滞发育和胚胎中有碎片与胚胎的凋亡有关，正常发育的胚胎凋亡小体发生率极低。Brener等[18]进一步证实，Bax和Bcl-2mRNA皆存在于2细胞至致密桑椹胚的所有植入前胚中，且Bax/Bcl-2的比率可预示胚胎的存活力。Liu等[1]用RT-PCR法亦证实退化胚胎中表达Bax和Fax基因产物，从而证实胚胎发育的好坏确定与细胞凋亡有关。在Liu等的研究中还观察到一有趣现象，卵母细胞不表达Bax、p53及Bcl-2等基因产物，而受精后的胚胎却表达，提示受精可能启动了人胚胎凋亡相关基因的表达，但这种现象及其引起的原因还值得进一步探讨。
结 论
随着细胞凋亡研究的深入，女性生殖活动中细胞凋亡的研究也已取得很大进展。卵巢GCs的凋亡不仅受到p53、Bax、Fas、WT-1、Bcl-2等凋亡相关基因的调控，而且受到IGF、IGFBP、激活素，IFNγ等体液因子的调控，且它们的调控皆受促性腺激素的影响，提示卵巢GCs的凋亡主要受体液因素的调节。GCs凋亡细胞内机制可能与caspases途径及酰基鞘氨醇途径有关。不同GCs亚群以及卵泡发育的不同时期GCs对凋亡的敏感性亦不同。子宫内膜细胞亦发生凋亡，主要见于功能层，其凋亡可能受E和P的调节。GCs及子宫内膜细胞凋亡的研究，主要为临床服务，凋亡不仅与ET的发生有关，而且与女性不孕有关。目前，除了应对GCs和子宫内膜细胞凋亡的确切机制进一步探讨外，还应着重利用凋亡的有关机制来解决临床上相关问题，如：能否通过抑制妊娠早期成熟黄体的凋亡，来治疗习惯性流产；能否通过促进异位子宫内膜组织凋亡来治疗ET；能否在IVF-ET中胚生存的介质中加入凋亡抑制剂以提高胚存活力和质量；以及能否通过抑制卵泡细胞凋亡来减缓卵泡的排空，从而推迟月经，延缓衰老等等。总之，女性生殖活动中细胞凋亡的研究还有待进一步深入。
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