生物超弱发光及其应用研究概述
关键字：生物 超弱发光
生物超弱发光(UltraweakorSuperweakbioluminescence)，简称超弱发光，又叫超弱光子辐射（UltraweakPhotonemission）、自发光（SpontaneousLuminescence）、超弱化学发光（UltraweakorsuperweakChemiluminescence）[1]。超弱发光是一种低水平的化学发光，发光强度极其微弱，仅为100-103hv/(s.cm2)，量子效率也很低，约为10-14-10-9，波长范围为200-800nm[2-6]。实际上超弱发光早已为人所知，早在1923年，前苏联科学家G.Gurwitsh在有名的“洋葱试验”中就已发现了超弱发光现象[7]。但是，由于仪器条件的限制，直到1954年意大利人Colli等利用装有光电倍增管的仪器才首次科学地证明了超弱发光现象[8]。到了六十年代，前苏联科学家对超弱发光进行了大量研究，Mamedov[9]对90余种生物的测定发现，除蓝藻和原生动物外，所有生物都有不同程度的发光，证明了超弱发光的普遍性。Slawinska等更进一步，提出任何生命物质都存在着超弱发光现象[10]。到目前为止，人们已对于超弱发光的机理及应用开展了大量研究工作，取得了可喜成绩，但都还有待进一步深入[3]。
我国超弱发光研究起步较晚，主要在应用研究上开展了一些工作。中国科学院生物物理研究所等单位在人和动物上进行了大量有益的研究[11-23]。七十年代末以来，甘肃农业大学等单位在农作物、豆科牧草、沙生植物和水果的抗生（尤其是抗旱性）鉴定上[24-43]进行了大量探讨，农作物已涉及小麦、玉米、大豆等8种，其中对小麦、玉米研究最多。理化因子如稀土、特定电磁辐射、电离辐射、氧化剂及代谢抑制剂等对超弱发光的影响也已涉及[28、40、44、49]。纵观这些年来我国超弱发光研究的历程，总的来说取得了一定的进展和成绩，但也存在着一些不足。这里仅就超弱发光的机理、测量、理化影响因素，及其在我国农业和医学中的应用研究加以概括和总结，以便对过去的工作有一个总的了解和回顾，并为今后进一步研究提供有益参考。
1超弱发光的机理
代谢和核酸合成是生物超弱发光的两主要来源，萌发绿豆中这两者和约为96%[44]。代谢发光又主要来源于氧化还原等代谢过程，如脂肪酸氧化[50、51]、酚的醛的氧化、H2O2的酶解、花生四烯酸的氧化、儿茶酚胺和单宁的过氧化，醌的氧化裂解[4]、蛋白质和氨基酸的氧化[52]等。氧化剂D2O明显增强血红素蛋白的发光强度[49]、呼吸抑制剂NaN3对萌发绿豆超弱发光的抑制达72%[44]等都是极好的例证。关于代谢发光的机理，Valadimirov曾提出过酶反应机制学说，认为它来源于代谢产生的过氧化物的酶解；但现在一般认为代谢发光是不饱和脂肪酸氧化产生的过氧化自由基复合后形成的三重态过氧化物退激所致[4]Wright.J.R等研究发现，脂肪酸的最大发光值提取物对超弱发光和脂肪酸氧化酶相似的抑制作用；脂肪酸氧化酶抑制剂Co2+、Mn2+、Hg2+和EDTA同样也抑制超弱发光[53]，证明脂肪酸氧化是超弱发光的主要来源之一。核酸DNA和RNA的合成反应是超弱发光的另一个来源，它在绿豆种胚超弱发光中约占24%[44]。关于核酸的超弱发光，Popp等提出过DNA光子贮存假说和分化的物理模型[54，55]。Rattemeyer等根据溴化忆锭对超弱发光的影响，也初步证明了DNA是一个超弱发光源[56]。马文建等还对DNA发光特异性进行了研究[57]，结果表明在所有碱基中只有鸟嘌呤能够发光，且发光强度与浓度（亦即DNA浓度）成正相线性关系。该研究还发现，鸟嘌呤衍生物发光强度因取代基不同而不同，鸟嘌呤＜鸟嘌呤核苷＜脱氧鸟嘌呤核苷＜一磷酸鸟苷＜三磷酸鸟苷＜脱氧一磷酸鸟苷＜脱氧三磷酸鸟苷；甲基化对发光有抑制作用，O6甲基化和N7甲基化鸟嘌呤核苷酸的发光强度仅为正常核苷酸的15%，毛大璋等研究了核酸代谢抑制剂对萌发绿豆超弱发光的影响[44]。他们发现，虽然蛋白合成抑制剂环已亚胺通过抑制蛋白质合成中的移位酶迅速阻断了细胞质中的全部蛋白质合成反应，但并没有对超弱发光产生影响。因此，蛋白质合成过程对超弱发光没贡献。并由此推断出，核酸代谢抑制剂放线菌素D之所以抑制超弱发光是因为它抑制了DNA发光和/RDA合成。因此，DNA和/RNA合成是超弱发光的一个来源。关于物理因素引起的超弱发光，Sapezhinskii等认为，是这些环境因素作用下生物体内产生的各种自由基（尤其是过氧自由基）经过一系列反应后生成的单线态氧和激发态羟基退激发光[58]。
2我国农业中的超弱发光应用研究
2.1作物的超弱发光特征
作物幼苗不同器官间超弱发光强度有差异，根（或胚根）发光最强[28，33，38，39]，因为种子萌发后细胞分裂活动主要集中在胚根的分生区[24]。于这一点，国外有类似报道，对小麦、菜豆、扁豆和玉米的研究显示，根的发光强度是茎的的10多倍[8]。但也有例外，在玉米根、芽、胚、种中，芽的发光强度最大[31]。对大豆的研究显示，子叶的发光强度高于真叶[61]，究其原因，子叶是苗期养分的主要来源，而真叶才刚开始生长。作物萌发过程中，超弱发光的动脉变化呈现单峰曲线[31，32，35，58]，中期发光强度萌发比前期和后期高出2-3倍[32]，发光量在总发光量中占绝大部分[35]。但有的研究也显示萌发过程中发光强度呈双峰曲线；并认为第一峰主要与营养物质的分解代谢（主要是不饱和脂肪酸的氧化）有关，第二峰主要与有丝分裂有关，两者同行并存；但峰值出现的早晚因作物种类而不同[28，60]。不同物物间超弱发光强度有所不同，比如苗期发光强度大麦＞小麦＞玉米，反映了它们在干旱适应性上的差异[37]。种子超弱发光强度与某些物质的含量有关，豆科牧草种子萌动之初，超弱发光强度与干种子中饱和脂肪酸C014-18、棕榈酸、ATP含量呈负相关，和双健不饱和脂肪酸C1-318-24含量成正相关[38，39]，这和一些沙生植物是一致的[41]。作物籽粒的发光强度与成熟度及着生部位有关，对玉米的研究表明，成熟度小的籽粒高于成熟度大的籽粒[61]。其原因在于，授粉初期籽粒主要器官分化，细胞分裂和呼吸作用强；进入完熟期后，籽粒新陈代谢和细胞分裂减弱，超弱发光也相应减弱。此外，不同着生部位的籽粒超弱发光强度也有所不同，授粉48天后的玉米果穗，上部籽粒＜中粒籽粒＜下部籽粒；采后贮存30天的果穗，发光趋势正好相反，前者反映了果穗的发育和成熟过程，后者则反映了玉米是穗收获后穗部营养物质转运和累积的规律。
2.2缺失体和种子活力
三种大豆脂肪酸氧化酶同工酶缺失体Lox1、Lox2、Lox3及其组合缺失体的子叶和真叶有相同的发光规律，双缺失体＞单缺失体＞正常品种，表明缺失体苗期叶片的超弱发光与脂肪酸氧化酶的基因型有关，这也许可以成为鉴别脂肪酸氧化酶同工酶缺失体的指标[59]。国外对这三种缺失体也有研究，据Jinyewang等报道，三者及组合的组织匀浆中，Lox1+Lox3的发光强度最低[61]。种子超弱发光强度的高低能在一定程度上反映种子活力的大小，马铃薯整种子及其粉碎后的提取液超弱发光强度均与发芽率和发芽指数呈显著或极显著正相关关系[25]。用超弱发光强度鉴定种子活力，样品量少又不破坏种子，对于种子量少的珍贵品种极其有益。
2.3抗生研究
2.3.1抗穗发芽能力、抗冷性、抗盐碱不同抗穗发芽能力小麦品种完熟期贮藏幼苗的超弱发光强度有相同趋势，休眠期短的品种（易带穗发芽）＞中抗品种＞抗性品种[26]。因此，籽粒超弱发光强度可作为鉴定和筛选抗穗发芽品种的依据。只要把品种按发光值和统计结果排列，即可把抗性品种和抗性差的品种分开，而且条件单一，不需模拟逆境。
低温能降低超弱发光强度，低温下萌动7-8天的玉米籽粒[24]发光强度不及室温下的三分之一；且同样的低温，抗寒品种发光强度显著高于不抗寒品种，这种低温萌动时品种间发光强度的差异性品种抗冷性一致的表现，为筛选抗寒品种提供了一种简捷的鉴定方法。稀土有利于提高根系活力和发光强度[40]。但稀土只是在作物自身抗寒基础上发挥效力。随着温度的下降可能出现类似“闪光”的现象，比如冬天小麦在（40C-O0C-40C）降温过程中，根系活力随之下降，根系超弱发光强度好反而有所提高。水果对低温的反应和萌发强度却反而有所提高。水果对低温的反应和萌发种子有所不同，将葡萄和金拮分别贮藏在低温和室温下，结果，在贮藏过程中发光强度没有显著变化，而且两种处理亦无显著差异[42]。
用NaCI溶液对种子进行盐分胁迫处理，结果显示，高抗盐品种的发芽率和超弱发光强度均高于敏感品种[28，40，43，60]，耐盐苜蓿的发光值、代谢和生长速率无大的变化，敏感品种则有显著改变[60]。盐分胁迫将降低超弱发光强度，用0.5%naCI溶液萌发的大麦发光强度显著低于对照无显著差异，大豆则差异明显，这是因为小麦属中抗盐作物，而大豆属不抗盐作物[43]。稀土能提高作物耐盐能力，稀土溶液浸种能减弱盐胁迫引起的春、冬小麦发光强度降低的程度，且冬小麦比春小麦效果更明显[40]。
2.3.1抗旱性作物籽粒和幼苗超弱发光都能在一定程度上反映品种间抗旱性差异。不同抗旱性小麦品种籽料的发光强度各有一定的范围，且抗旱性越超弱发光值也越高[30]，这与冬小麦和荞麦幼苗的试验结果是一致的[32，36]。用籽粒的超弱发光强度来鉴定作物的抗旱性有许多优点，简单易行，速度快，样品量少，又不破坏种子，对种子量少的珍贵品种尤其适宜。但是，仅仅根据超弱发光值的方差分析结果来对品种进行抗旱性分类，则无论用LSR0.05还是用LSR0.01作为分类标准，其中都有可属于抗旱性中等的中间类型[30]。
荞麦幼苗的发光强度抗旱品种大于不抗旱品种[36]。玉米抗旱自交系根的超弱发光积分值高于不抗旱自交系；根芽、根胚、根种超弱发光积分值的比值，萌发前期抗旱自交系大于不抗旱自交系（超弱发光积分优值与总积分值的比值亦如此）；后期则相反[31]，大麦超弱发光的最高峰值亦有类似规律[35]。冬小麦抗旱品种萌发过程五个龄期的的超弱发光总值比不抗旱品种大（大麦[35]也是这样），超弱发光持续不衰时间也比不抗旱品种长[32]。芝麻幼苗根茎，根叶超弱发光的的比值，抗旱性品种比不抗旱品种高[33]。（辣椒[34]、小麦[40]）萎蔫后的复水能力与超弱发光强度呈正样关系，这在评价品种抗旱能力方面有实际意义[40]。不同抗旱性品种在萌发过程中有不同的发光动态，（小麦、大麦[37]）抗旱品种萌发初期芽和根的超弱发光都很强，第二叶比第一叶发光水平更高，且在整个萌发过程中根的发光长盛不衰；不抗旱品种第一、二叶的发光水平都比较低，虽然萌动之初根的发光值占极大比重，但短时间内又很快下降；中抗品种则介于两者之间。这种发光部位动态过程的不同，有可能成为快速鉴定、早期筛选抗性品种的一种简便方法。
此外，人们还对水分胁迫和模拟干旱条件下作物幼苗的发光情况进行了研究。小麦萌发过程中用20%聚乙二醇进行水分胁迫处理，2小时后发光值有所下降，此后一直趋于较低水平，并且无明显的峰值出现[28]。（小麦、大豆和玉米等[27，29]）作物种子萌发时用蔗糖模拟干旱（简称模拟干旱），超弱发光强度有所降低；但不抗旱品种降低程度显著大于抗旱品种。在模拟干旱条件下萌发时，发光强度抗旱品种显著高于普通品种与蒸馏中萌发情况相反[29]。
2.4理化因素对超弱发光的影响
超弱发光强度与环境因素有关，理化因子，如特定电磁波（简称PDP）、氧化剂、代谢抑制剂、稀土和电离辐射等，都可以改变发光强度。经TDP辐照的大豆干种子，在整个萌发过程中，超弱发光值始终高于未辐射种子[45]，这与TDP辐射能提高种子活力，促进种子萌发，促进幼苗生长，增强萌发种子的代谢活动是一致的。（水稻、陆稻、小麦、玉米和萝卜等[48]）作物种子刚经TDP辐照完时，发光强度较高，但不稳定；照后放置24小时此现象即可消除。TDP也对精子的超弱发光有影响[46]，家兔精子经TDP辐照后孵育，结果，发光值均高于对照，其中8分钟对照组与对照组差异极显著。加氧化剂是增强发光的又一方法。小麦种子[28]萌发过程中，分别于6小时和72小时用1%KMnO4溶液处理，发光强度可分别增加10.8%倍和2.5倍，增强幅度随萌发时间的延长而减小，这是因为，代谢的氧化底物随着萌发时间的推移而减少。在血红素蛋白研究中也发现了氧化剂对发光的增强作用，D2O2能明显增强血红素蛋白的发光强度；自由基清除剂则产生相反的作用一抑制超弱发光，但不同自由基清除剂间有差别，B-Car，对血红素蛋白的发光有很大的抑制作用，而甘露醇和苯甲酸钠则无甚功效[49]。稀土能提高（液体培养的玉米、冬小麦、辣椒和甜菜等[40]）根的超北发光强度和活力，但稀土只在一定范围内起作用，遗传特征是发光特征及根系活力的决定因素。
（紫外线[47]、X-射线、r射线[63]等）电离辐射也能提高超弱发光的强度。经X-射线照射后V70细胞发光强度明显增强，累积照射26.5GY，超弱发光总超弱发光峰值出现的位置，辐射细胞和未辐射细胞的发光峰均在634.6nm出现。用X射线或r-射线照射CHO细胞和V79细胞，当辐射剂量小于26.5GY时，超弱发光强度与辐射剂量性相关。辐射增敏剂Misonidazole能增加X-射线和r-射线诱发的发光强度，但不变发光强度一辐射剂量间的线性关系；另，仅含Misonidazole的培养液的发光有受辐射因素的影响。紫外线对超弱发光具有促进和抑制两种可能作用，经紫外线照射10分钟的大豆种子萌发后光峰值和发光均值都比对照高将近两倍，而照射60分钟的大豆种子反而明显低于对照；加入冷光剂后发光作用得到了加强，但发光趋势不变[47]。
对萌发绿豆的研究显示，不同代谢抑制剂对超弱发光有不同的影响[44]。NaN3抑制大部分与氧化有关的发光，放线菌素D（AD）则抑制与核酸合成有关的发光。呼吸受抑制引起的ATP等的缺乏必然会降低核酸的合成速度，因此，AD和NaN3对超弱发光的抑制既各不相同，又相互影响部位不同。EB是插入DNA分子使DNA双螺旋结构解开从而引起超弱发光增强；AD则主要是通过抑制RNA的合成抑制超弱发光。此外，EB能消除AD对发光的抑制，但不影响NaN3和AD联合处理对发光的抑制。
3超弱发光在人体和运行研究中的应用
人体体表不同部位超弱发光强度有差异，手指＞手心＞面颊[13]，仅就手而言，指尖＞手心＞虎口＞手背[11]。人体体表有14条高发光线，其中92.97%与《灵枢经》中描绘的人体十四经的体表经穴、经线的高发光生物物理特性。病人某些部位的发光强度不对称，如单侧颜面神经麻痹和面肌痉挛者的左右商阳穴[11]。不同刺激剂对人外周血多形核白细胞（PMN）发光的刺激作用有别[15]，酵母多糖（OZ）和伴刀豆球蛋白刺激效率低，持续时间短；佛发波醇刺激效率高，低浓度即能使PMN稳定发光达6小时。另外，测量体系中血含量也对PMN受激发光有影响，105左右含血量最佳。针刺能增加动物某些穴位发光强度，对家兔的研究[12]显示，电针刺外关穴前后同侧耳部发光强度有显著差异；而针刺非经穴部位，未见明显变化，验证了祖国医学外穴与耳部位存在特殊的三焦经经络通路的论述，以及经穴对机体生命活动特有的调整作用。该研究还发现，用药物封闭周围神经通路后，电针刺激不能明显改变发光强度，证明在经络激动剂和抑制剂对超弱发光有相反的作用。fMLP、A2387等均可刺激大鼠腹腔中性粒细胞和次黄嘌呤一黄嘌呤氧化酶系统发光[23]。超弱发光在癌症研究中也得到了应用，畸胎癌组织抽提液的发光峰值603nm和651nm与原卟淋IX标准样品基本吻合，证明畸胎癌组织中有卟啉[21]。另一项研究还发现，卟淋和白蛋白复合物的发光特性与临床诊断中选择的癌固有特征峰或患者血清特征峰相吻合[22]。超弱发光在国内经络研究上应用较多，目前已在循经感传与经穴发光的定量关系、人体体表冷光变化与针刺对人体的调节作用、以及喻穴、特定穴、交会穴、子母穴的冷光特性等研究中取得初步进展，部分验证了祖国医学的有关经络学说[12]。
兔和大鼠[16，17]油酸肺损伤时H2O2能显著提高发光值和降低发光衰减系数。经H2O2处理的兔血浆发光强度明显高于全血和红细胞悬液；但溶血后三者的发光值均显著增加，其中全血和红细胞悬液发光值分别增加了15.5倍和6.1倍。白细胞降低90%后油酸性肺损伤发光值的升高程度显著减小，支气管肺泡藻洗液中蛋白含量和化学发光水平也显著降低，表明白细胞在肺内聚集将加重肺损伤程度。离体的不同发育时期的鸡胚神经细胞的发光有很大差异[19]，9天以后的鸡胚神经细胞有明显的特征曲线，该曲线的产生与外界的温度、氧、电场作用和光照等因子有关。温度由410C降到370C过程中，发光强度亦降低，同时最大峰位置后移，但当温度低于370C时，则特征曲线变得不明显；外界电场和光照能使发光迅速增加，但不能改变发光曲线的特征，且移去外电场后，能迅速恢复到原发光水平。苯对水介质中鲤肝微粒体的发光有增强作用，但需要适量过渡金属离子F2+或Cu2+存在；F2+诱导活力比Cu2+大，所用剂量仅为Cu2+的1/6，且两者的作用方式也有区别，F2+所刺激的肝微粒体发光是陡升陡落，Cu2+则是缓升缓降[19]。超弱发光与许多生理生化反应有关，对绵羊精子的研究发现，发光强度与活力、呼吸、果糖酵解、磷酸肌酸呈正相关，这种发光与活力和能量代谢间的内在联系，反映了精子能量转化过程，是评价品质很有价值的指标[20]。
4超弱发光的测量
现在简要谈一下检测方法和检测系统[4]。超弱发光的测定主要是基于光电倍增管的检测方法，共有测量输出电流（DC法）、测量输出电流中的交流成分（AC法）、单光子计数（SPC法）和同步单光子计数（SSPC法）等四种方法，其优越性为DC法＜AC法＜SPC法＜SSPC法，但现在常用的主要是后两种。常用的检测系统有，BCL发光测定仪、Beckman公司生产的LS-5801、LS-9800液体闪烁计数器的单光子计数装置，以及EM19789QB型、EM19635QB型、GDB-52型等光电倍增管装配的仪器。
光致发光和温度对超弱发光的测定有很大影响。超弱发光通常包括光致发光和自发发光，但光致发光比自发发光的成分强得多[5]，因此必须消除光致发光的影响。消除光致发光有多种发光有多种方法，通常是测量暗避光处理，测量时避光。暗避光时间的长短，不同试材有所不同，萌发马铃薯种子需要5小时[25]。3T3细胞[5]和小麦幼苗、淡水蚤[2]需要1-2小时，大鼠血液[5]、CHO细胞[45]、萌发绿豆种子[5，44]都很短，仅需几分钟。温度对超弱发光也有影响，发光强度随着温度的升降而增强的减弱[24]、，将样品放入比它低几度的样品室中，5分钟后，与温度不平衡相关联的可衰减发光就只剩下了近1/4[44]。还有人认为，为了降低光电倍增管的本底，提高信噪比，需将光电倍增管冷却到300C或更低。由于超弱发光太弱，有必要增强发光以利于测定。增强超弱发光的方法很多，如引入活化剂、H2O2，以及通过电流等，现在主要是向样品中加入新配制的冷光剂[31-33，37-39，45，63]。辐照处理时可同样加入辐射增敏剂，对活细胞CHO和V79的研究表明辐射增敏剂Misonidazole能增强超弱发光强度[63]。
综上所述，经过二十余年的努力，我国在生物超弱发光，尤其是农作物的抗逆研究中，已取得了可喜成绩和进展，这为我国生物超弱发光的进一步深入研究打下了基础，对于后继者也是一个很大的策动力，但应该看到的我国超弱发光的研究领域尚存在一些问题，值得大家关注。主要集中在应用研究上，我们认为今后应强化这方面的工作，机理的研究能推动应用研究，并为应用研究提供坚实的理论基础。在应用研究方面，尤其是作物抗性研究方面有必要拓宽范围和增加深度。在抗逆研究中，目前已有的结果大都仅仅反映了超弱发光与作物抗逆性之间的定性关系，没有量化。笔者以为，每种作物都应测量尽可能多的不同抗逆性的品种，然后在超弱发光指标与抗逆性之间建立定量关系，即数学模型。有了这样的模型，对于一个抗逆性未知的样品，只要测出它的超弱发光指标，即可得出其抗逆性大小，也只有这样，超弱发光在抗逆研究中才能真正发挥作用。此外，还应将超弱发光机理与作物抗逆性机理联系起来研究，而不是仅着眼于两者的表面联系，这样才能从更深的层次探索两者的本质联系，使超弱发光及其应用研究向前跨一大步。
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