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IL?18基因多态性与原发性干燥综合征的相关性
作者：李恩泽 辛苗苗 胡彬 闫丽萍 李慧
【摘要】 目的 探讨IL?18基因?137G/C、?607C/A位点多态性及其血清水平与原发性干燥综合征的相关性。方法 提取受试者白细胞DNA，采用聚合酶链反应?限制性片段长度多态性技术检测28例原发性干燥综合征病人和52例健康对照者IL?18基因?607C/A、?137G/C位点多态性，酶联免疫吸附(ELISA)法检测两组血清IL?18含量。结果 两组IL?18基因?137G/C、?607C/A位点基因型频率及等位基因频率比较差异均无显著性(P>0.05)。原发性干燥综合征组血清IL?18水平明显低于健康对照组，差异有显著性(t=24.06,P<0.001)。原发性干燥综合征组不同基因型间血清IL?18水平比较差异均无显著性(P>0.05)。结论 血清IL?18水平表达降低可能是原发性干燥综合征的促发因素。
【关键词】 白细胞介素18;基因型;基因频率;原发性干燥综合征
[ABSTRACT] Objective To investigate the association of polymorphisms of ?607C/A, ?137G/C promoters of IL?18 gene and its serum level with primary Sjogren’s syndrome. Methods The DNA of white blood cells were extracted from subjects,polymerase chain reaction?restriction fragment length polymorphism (PCR?RFLP) method was applied to detect polymorphisms of ?607C/A, ?137G/C promoters of IL?18 gene in 28 patients with primary Sjogren’s syndrome (group A) and 52 healthy controls (group B); serum IL?18 was measured in both groups by ELISA. Results There was no differences in IL?18 genotype frequency and allele frequency at position ?607 and ?137 between group A and group B (P>0.05). Serum IL?18 in group A was significantly lower than that in group B, with statistical difference (t=24.06,P<0.001). The differences of serum IL?18 levels between different genotypes in group A did not reach statistical significance (P>0.05). Conclusion Decrease of serum IL?18 is likely to be a precipitating factor of primary Sjogren’s syndrome.
[KEY WORDS] interleukin?18; genotype; gene frequency; Sjogren’s syndrome
原发性干燥综合征(PSS)是以口、眼干燥及关节肿痛为常见表现的一种全身性自身免疫性疾病，常呈现家族聚集性。白细胞介素?18(IL?18)可诱导IFN?γ、IL?2等细胞因子产生，调节Th1/Th2细胞平衡，有增强免疫、抗肿瘤的作用，并参与某些自身免疫性疾病和变态反应性疾病的发生发展。PSS病人CD4+T细胞水平降低，导致Th1和Th2亚群的分布出现异常，进而引起机体细胞因子网络调控失常。本文对PSS病人IL?18基因?607C/A、?137G/C位点多态性以及血清IL?18水平进行检测，探讨其与PSS发生的相关性。现将结果报告如下。
1 对象与方法
1.1 研究对象
收集我院风湿免疫科就诊的PSS病人(PSS组)28例，男1例，女27例，年龄27～84岁，平均为55.96岁，均符合2002年PSS国际分类(诊断)标准提出的诊断标准。另选健康献血员52例作为对照组，男3例，女49例，年龄22～75岁，平均53.2岁;排除相应疾病家族史。两组研究对象均无血缘关系，在年龄和性别比例上均无显著性差异。
1.2 检测方法
1.2.1 DNA制备 采集受试者空腹静脉血5 mL至EDTA?K2抗凝管中，颠倒混匀。离心后提取下层血浆和白细胞层约1 mL移入高压灭菌的离心管中，用酚?氯仿?异戊醇法抽提细胞DNA。将DNA沉淀移入1.5 mL的LEP管中，12 000 r/min离心10 min，弃去上清液，沉淀自然干燥后，加无菌纯水充分溶解，置4 ℃冰箱保存备用。
1.2.2 PCR检测 参考文献[1]设计扩增 IL?18基因?607位点的特异性引物，2条特异性正向引物序列分别为5′?GTTGCAGAAAGTGTAAAAAT?TATTAC?3′和5′?GTTGCAGAAAGTGTAAAAA?TTATTAA?3′，共同反向引物序列为5′?TAACCT?CATTCAGGACT?3′，质控正向引物序列为5′?CTT?TGCTATCATTCCAG?3′。?137位点2条特异性正向引物序列分别为5′?CCCCAACTTTTACGGA?AGAAAAG?3′和5′?CCCCAACTTTTACGGAAG?AAAAC?3′，共同反向引物序列为5′?AGGAGGGC?AAAATGCACTGG?3′，质控正向引物序列为5′?CCAATAGGACTGATTATTCCGCA?3′。?607位点的PCR总体系为25 μL，包括10×PCR缓冲液2.5 μL(含2.0 mmol/L MgCl2)，0.25 mmol/L 的dNTP，约30 ng基因组DNA和1 U Taq聚合酶。质控正向引物0.4 μmol/L，一种特异性正向引物0.4 μmol/L，共同反向引物0.8 μmol/L。扩增参数：首先94 ℃预变性4 min;然后94 ℃变性20 s，62 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共行7个循环;随后94 ℃变性20 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共进行35个循环。取2条特异性正向引物分别扩增的PCR产物于20 g/L琼脂糖凝胶中电泳，电压80 V，40 min，溴化乙锭染色，紫外线凝胶成像系统观察结果并鉴定等位基因频率。?137位点的PCR总体系为25 μL，包括10×PCR缓冲液2.5 μL(含2.0 mmol/L MgCl2)，0.2 mmol/L dNTP，约30 ng基因组DNA和1 U Taq聚合酶。质控正向引物0.5 μmol/L，一种特异性正向引物0.5 μmol/L，共同反向引物1.0 μmol/L。扩增参数：首先94 ℃预变性2 min;然后94 ℃变性20 s，68 ℃退火60 s，共行5个循环;随后94 ℃变性20 s，62 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，共进行25个循环。取2条特异性正向引物分别扩增的PCR产物于20 g/L的琼脂糖凝胶中电泳，电压80 V，40 min，溴化乙锭染色，紫外线凝胶成像系统观察结果并鉴定基因型。
2 结 果
2.1 IL?18基因?607位点多态性电泳
每份标本分别用2条特异性正向引物做2管PCR，301 bp处为质控条带，196 bp处是A/C等位基因特异性扩增片段。部分标本?607位点多态性检测电泳结果如图1。标本①只有C等位基因处可观察到长196 bp特异性扩增片段，所以其基因型为CC;标本②～④的2管PCR产物电泳后均可观察到长196 bp特异性扩增片段，故其为CA基因型;标本⑤只有A等位基因处可观察到长196 bp特异性扩增片段，其基因型则为AA。
2.2 IL?18基因?137位点多态性电泳
图2为部分标本IL?18基因?137位点多态性电泳检测结果，每份标本分别用2条特异性正向引物做2管PCR，446 bp处为质控条带，261 bp处为G/C等位基因特异性扩增片段。标本②和④只有G等位基因处可观察到长261 bp特异性扩增片段，所以其基因型为GG;标本③和⑤在两管PCR产物电泳后均可观察到长261 bp特异性扩增片段，其基因型为GC;标本①只有C等位基因处可观察到长度为261 bp特异性扩增片段，其基因型则为CC。
2.3 两组IL?18基因?137G/C、?607C/A位点基因型频率和等位基因频率的比较
两组IL?18基因?137G/C、?607C/A位点基因型频率及等位基因频率比较，差异均无显著意义(P>0.05)。见表1、2。
2.4 两组血清IL?18水平的比较
PSS组病人和对照组的血清IL?18水平分别为(49.37±15.77)和(476.79±93.17) ng/L，两组比较差异有显著性(t=24.06,P<0.001)。
2.5 IL?18不同基因型病人血清IL?18水平比较
PSS组病人IL?18基因?607位点CC、CA、AA基因型的血清IL?18水平分别为(47.97±13.58)、 (951.41±9.6)、(48.97±9.36)ng/L，IL?18基因?137位点GG、GC、CC基因型的血清IL?18水平则分别为(50.05±9.97)、(48.16±11.60)、(52.80±0.00)ng/L，不同基因型间血清IL?18水平比较差异均无显著性(P>0.05)。见表2。
表1 IL?18基因?607 C/A位点多态性分布及其比较(例(χ/%))组别n基因型频率CCCAAA等位基因频率CA对照组5213(25.0)28(53.8)11(21.2)54(51.9)50(48.1)PSS组287(25.0)14(50.0)7(25.0)28(50.0)28(50.0)
表2 IL?18基因?137 G/C位点多态性分布及其比较(例(χ/%))组别n基因型频率GGGCCC等位基因频率GC对照组5238(73.1)13(25.0)1(1.9)89(85.6)15(14.4)PSS组2822(78.6)5(17.9)1(3.5)49(87.5)7(12.5)
3 讨 论
PSS是一种慢性系统性自身免疫性疾病，在多种因素的共同作用下，可导致机体细胞和体液免疫异常，表现为淋巴细胞和浆细胞对靶器官的进行性浸润，造成靶器官功能障碍。研究表明，PSS病人疾病活动期体内T细胞亚群数量分布存在明显异常，表现为CD4+T淋巴细胞水平降低，而CD8+T淋巴细胞水平升高[2?3]。CD4+T淋巴细胞水平降低，导致Th1和Th2亚群的分布出现异常，进而引起机体细胞因子网络调控失常，如PSS活动期病人体内IFN?γ等细胞因子水平有明显下降，对疾病的进展影响较大[4]。IL?18属于IL?1家族成员，它可诱生IFN?γ等细胞因子。INF?γ的生成可促进Th0细胞向Th1细胞分化，从而调节Th1/Th2细胞平衡，因此认为，IL?18是调节Th1/Th2细胞因子的重要因子[5]。MATERA等[6]研究表明，IL?18在IL?12诱导新生CD4+T淋巴细胞分化为Th1细胞时起加强作用，在IL?12协同作用下，IL?18可强烈诱导IFN?γ等Th1型细胞因子的产生，导致组织损伤。本研究结果显示，PSS病人血清IL?18水平明显低于对照组，推测PSS病人血清IL?18水平降低可能导致Th1细胞分泌IFN?γ水平下降，Th2细胞分泌IL?4水平相对增高。进一步引起Th1型细胞免疫反应下调而Th2型细胞免疫反应相对增强，Th1/Th2细胞免疫失衡扩大，使机体在多种因素的侵袭下引起免疫反应异常，通过各种细胞因子和炎症递质的作用，造成PSS病人组织的损伤。 细胞因子的表达量受基因调控，编码细胞因子的结构基因转录效率下降可导致细胞因子的表达量降低。近年来，对IL?18基因启动子区单核苷酸多态性(SNP)与疾病的关系研究有诸多报道，许多研究结果显示，IL?18 基因多态性能影响疾病的发生、发展[7?9]。IL?18基因?607C/A和?37G/C位点分别存在核因子cAMP反应元件结合蛋白和组蛋白H4转录因子结合部位，SIVA等[9]研究认为其多态性可能影响IL?18的转录水平。张平安等[10]采用体外PBMC培养和刺激方法研究IL?18 基因型和表型的关系，结果表明两个位点的基因多态性对IL?18分泌和表达无明显影响。本研究对IL?18基因?607C/A、?137G/C位点多态性分析结果表明，两组IL?18基因?607C/A、?137G/C位点基因型频率和等位基因频率均无显著性差异，未得出IL?18基因?607C/A、?137G/C位点多态性与PSS相关的结论。同时，对不同基因型间的血清IL?18水平进行统计学分析，也未得出基因多态性可影响IL?18血清水平的结论。由此推断，IL?18基因?607C/A、?137G/C位点多态性与某些疾病的易感性有关，并非完全是通过对于其表达量的影响而发挥作用，可能是该位点与其他相邻位点存在连锁失衡的共同结果，也可能与样本大小、种族差异、地域差异以及遗传因素和环境因素之间存在着复杂的相互作用等原因有关。
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