大肠杆菌表达人IL?21融合蛋白的纯化和抗原性分析
作者：付强 钱冬萌 闫志勇 侯伟 王斌
【摘要】 目的 在大肠杆菌中表达人IL?21编码基因，并进行蛋白纯化和抗原性分析。方法 以经PHA刺激的人扁桃体细胞cDNA 文库为模板，经PCR获得IL?21全基因片段。测序确认后，分别设计含BamHⅠ和SalⅠ酶切位点的引物，经PCR获得IL?21成熟肽的编码基因。将此IL?21基因插入表达载体pGEX?4T?2，重组克隆经酶切与测序确认后转化大肠杆菌DH5α,进行IPTG诱导表达。经琼脂糖珠结合的纯化方法所得产物用Western Blotting作抗原性分析。结果 SDS?PAGE显示经IPTG诱导后的大肠杆菌DH5α表达与理论相符的条带，并获得了与理论值相符的纯化条带，在进一步的Western Blotting分析中发现表达的蛋白能与IL?2的单抗产生结合反应。结论 人IL?21编码基因克隆载体在大肠杆菌中成功表达，同时建立了该蛋白的琼脂糖珠纯化方法，通过免疫印迹实验揭示了原核表达的IL?21蛋白与IL?2之间结构的相似性。
【关键词】 白细胞介素21; 基因表达;免疫印迹法；重组融合蛋白质类
［ABSTRACT］ObjectiveTo express coding gene of human interleukin?21 (IL?21) in E.coli, purify its protein, and assay its antigenicity.MethodsHuman IL?21 gene fragments were obtained from human tonsil cDNA by PCR. The coding gene for the mature N terminus of IL?21 was inserted into prokaryotic expressing vector pGEX?4T?2 and transformed into E.coli DH5α. The expressed product was purified by affinity chromatography using GST Fusion Protein Purification bead and its antigenicity analyzed by Western Blotting.ResultsInduced by IPTG, E.coli DH5α expressed the right molecular weight protein. Western Blotting test showed the protein had reaction with IL?2 monoclonal antibody.ConclusionThe vector pGEX?4T?2/IL?21 and engineering bacteria E.coli DH5α expressing IL?21 mature N terminus fusion protein is successfully constructed. By purification and Western Blotting test, the recombinant IL?21 revealed resemblant antigenicity to IL?2.
［KEY WORDS］Interleukin?21; Gene expression; Immunoblotting; Recombinant fusion proteins
以美国JULIA教授为首的研究小组在国际上首次构建了BaF3/IL?21R细胞系，并用此细胞系从活化的CD+3细胞中分离并鉴定了一类新的细胞因子——人白细胞介素21（IL?21）[1]，此后世界范围多个实验室相继进行了相关研究。现在已知IL?21具有广泛的生物学功能，能够调节体液和细胞介导的免疫应答，刺激T、B和NK细胞的增殖、活化和分化，并且对肿瘤细胞的生长有抑制作用[2～4]。本研究构建了中国人IL?21基因编码的重组质粒，并在大肠杆菌中进行表达[5]。同时通过进一步对表达产物进行GST亲和层析纯化后，使用IL?2单克隆抗体与重组蛋白做Western Blotting抗原性分析。现将结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 质粒、菌株和主要试剂
质粒pGEX4T?2和菌株E.coli JM109、E.coli DH5α均为本室保存。PCR试剂、T4 DNA连接酶、PCR产物纯化试剂盒、pGEM?T Easy Vector 试剂盒均购自Promega公司。DNA限制性内切酶BamH Ⅰ、Sal Ⅰ 均购自Takara公司。引物均由北京赛百盛公司合成(PAGE纯化)，GST Fusion Protein Purification bead 购自Amersham公司。
1.2 IL?21全编码基因的克隆
将经PHA刺激培养48 h的人扁桃体细胞总RNA逆转录为cDNA后，进行PCR扩增。利用T4 DNA连接酶将7.5 μL PCR纯化产物与0.5 μL T?Easy载体连接。同时，使用TSS法制备感受态大肠杆菌JM109，将连接产物转化后在涂有X?Gal和IPTG的ALB固体培养基上培养,37 ℃放置12～16 h。 通过蓝白斑法选择阴性、阳性克隆，从中提取重组质粒DNA，采用 PCR和酶切初步鉴定后，进行DNA序列测定分析。
1.3 IL?21重组表达质粒的构建
利用含BamHⅠ和SalⅠ酶切位点的引物，经PCR获得IL?21成熟肽的编码基因。经过纯化的PCR产物及载体pGEX4T?2同时用核酸内切酶BamHⅠ和SalⅠ消化后以T4连接酶连接，构建原核重组表达质粒。对用TSS法新鲜制备的感受态E.Coli.DH5α进行转化。对转化长出的菌落进行质粒小提，用限制性内切酶进行初步鉴定后，进行DNA序列测定分析。
1.4 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达
挑取单个重组成功菌落接种于5 mL Amp?LB中, 37 ℃震荡培养,当菌液吸光度达到0.4～0.6时,用终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导目的基因在大肠杆菌DH5菌中的表达。分别于诱导后1、2、4 h取菌液3 mL，12 000 r/min离心1 min，沉淀用SDS凝胶加样缓冲液震荡后置沸水浴5 min，稍微离心，上清移至新管,-20 ℃储存备用。同时，用DH5α宿主菌和未诱导的含重组质粒的DH5α菌，以及诱导的含pGEX4T?2质粒的DH5α菌样品作对照行SDS?PAGE。
1.5 表达蛋白的纯化和Western Blotting分析
根据37 ℃时蛋白表达情况，降低细菌的诱导温度到23 ℃进行大体积低温诱导3 h。收集菌液，经离心后，将菌斑用适当体积的PBS液洗涤两次后再次重悬，冰浴下超声裂解细菌。4 ℃，14 000 r/min离心10 min分离上清。将上清中加入GST Fusion Protein Purification bead震荡30 min纯化浓缩上清中的蛋白。将诱导的菌体、纯化的融合蛋白进行SDS?PAGE电泳，电泳后用Bio?Rad公司的电转仪将蛋白转至PVDF膜上。电转结束后将膜在丽春红染液中染色，用铅笔标记出蛋白Marker。然后，参照分子克隆实验操作。一抗为IL?2的单克隆抗体，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG。
2 结 果
2.1 目的基因的PCR扩增
PCR扩增的IL?21全编码基因长为642 bp，其中成熟N端编码基因长为396 bp。同DNA标准相对分子质量参照物相比，PCR扩增产物的大小与预测的结果一致（图1）。
2.2 原核重组表达质粒的鉴定
经PCR扩增出的IL?21成熟肽的编码基因片段和鉴定重组成功的质粒经双酶切后同时进行电泳，可见酶切产物和PCR扩增条带大小与理论
值相符（图2）。
2.3 表达蛋白的SDS?PAGE
经SDS?PAGE，考马斯亮蓝R?250染色观察，含重组质粒的诱导菌在相对分子质量为41 000位置出现一蛋白条带，而未诱导的重组质粒转化菌在相应位置没有蛋白条带；含质粒pGEX4T?2的诱导菌在相对分子质量为26 000位置出现一条带。目的基因表达的多肽相对分子质量估计为15 000，与融合蛋白共同表达相对分子质量约为41 000的多肽，与理论估计相一致。经凝胶成像扫描，融合蛋白产量占总蛋白的10%（图3）。
2.4 表达蛋白的纯化
大体积蛋白表达后，将细菌裂解液上清和纯化浓缩的蛋白进行电泳分析，结果显示得到理想的纯化融合蛋白条带(图4)。
将纯化的融合蛋白进行SDS?PAGE，电泳后作Western Blotting分析，结果可见有与理论相符的条带（图 5）。
3 讨 论
人IL?21是IL?2家族中的新成员，主要由活化的CD+4 T细胞产生，与IL?2、IL?15、IL?4等细胞因子具有高度同源性。其基因定位于4q26?27, 距离IL?2 基因约180 kb。结构分析表明，成熟的人IL?21 含有四螺旋族细胞因子结构域,该结构域与IL?2、IL?4、IL?15 的四螺旋族细胞因子结构域有较高的同源性。IL?21 与IL?15 在相同的位置有两对相同的半胱氨酸, 其中一对在IL?2、IL?4中具有保守性。最近通过核磁共振技术获得的高精三维结构表明，人IL?21有不同的同工异构体，并在细胞实验中呈现十分不同的活性[6]。
本实验从活化扁桃体细胞中克隆出人IL?21的cDNA并进行序列测定，同时构建了中国人IL?21表达克隆，并在DH5α宿主菌中表达出与谷胱甘肽转移酶融合的蛋白。采用琼脂糖珠结合的纯化方法，获得了与理论值相符合的纯化条带。在进一步的Western Blotting分析中显示，该种条件下表达的融合蛋白能与IL?2的单抗产生结合反应。这一实验结果结合人IL?21最新的结构分析和体外活性实验，进一步证实了人IL?21在临床与IL?2联用或单独使用具有的调节免疫功能和抗肿瘤活性[2,7]，并为进一步检测人IL?21的各种体内外活性奠定了理论和实验的基础。
【参考文献】
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[5]付强,钱冬萌,闫志勇,等. IL?21编码基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达[J]. 青岛大学医学院学报, 2003,39(1):15?17.
[6]BONDENSGAARD K, BREINHOLT J, MADSEN D, et al. The existence of multiple conformers of interleukin?21 directs engineering of a superpotent analogue[J]. J Biol Chem, 2007,282(32):23326?23336.
[7]BAAN C C, BALK A H, DIJKE IE, et al. Interleukin?21: an interleukin?2 dependent player in rejection processes[J]. Transplantation, 2007,83(11):1485?1492.
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