献血者EBV、HHV?6和HHV?7 DNA检测对输血意义
作者：杨永洁 尼宏莉 李欣 王笑峰 王云 于琦 罗兵
【摘要】 目的 了解青岛地区献血者单个核细胞（PBMC）和唾液标本中EB病毒(EBV)、人疱疹病毒6型(HHV?6)和人疱疹病毒7型(HHV?7)的感染情况。方法 采用PCR?Southern blotting检测109名健康无偿献血者外周血PBMC和唾液标本中EBV DNA，巢式 PCR技术检测HHV?6和HHV?7 DNA，限制性酶切分析分别对HHV?6、HHV?7进行分型和鉴定。结果 109名献血者外周血PBMC中EBV DNA检出率为21.10%(23/109)，HHV?6 DNA检出率为50.46%(55/109)，HHV?7 DNA检出率为57.80%(63/109)。唾液标本中EBV、HHV?6和HHV?7 DNA检出率分别为24.77%(27/109)、 66.06%(72/109)和90.83%(99/109)。PBMC中EBV、HHV?6和HHV?7均阳性者7例，占6.4%；唾液标本中均阳性者17例，占15.6％。酶切分析结果显示，55例献血者外周血PBMC HHV?6阳性标本中HHV?6A型占18.2%(10/55)，HHV?6B型占81.8%(45/55)；72例唾液HHV?6阳性标本中HHV?6A型占16.7%(12/72)，HHV?6B型为83.3%(60/72)。结论 外周血PBMC和口咽部上皮细胞是EBV、HHV?6和HHV?7潜伏的重要部位，献血员中存在上述病毒的共感染。
【关键词】 疱疹病毒4型,人；疱疹病毒6型，人；疱疹病毒7型，人；输血
［ABSTRACT］ Objective To investigate the prevalence of EBV,HHV?6 和 HHV?7 in peripheral blood mononuclear cel1s (PBMC) and saliva samples in blood donor. Methods PCR?Southern blotting was adopted to detect EBV DNA in PMBC and saliva of 109 blood donors in Qingdao; nested?PCR method to detect HHV?6 and HHV?7 DNA; restriction map to type and identify HHV?6 and HHV?7. Results Of the 109 blood donors, the detection rates of EBV DNA, HHV?6 DNA and HHV?7 DNA in PMBC were 21.10% (23/109), 50.46% (55/109) and 57.80% (63/109), respectively; in saliva, the rates were 24.77% (27/109),66.06% (72/109) and 90.83% (99/109), respectively. In PBMC, seven cases were with all the three items, EBV,HHV?6 and HHV?7, were positive, accounting for 6.4% (7/109); in saliva, the positive case was 17, accounting for 15.6％ (17/109). Restriction enzyme analysis revealed that 18.2% (10/55) of HHV?6A in PBMC and 16.7% (12/72) in saliva, 81.8%(45/55) of HHV?6B in PBMC and 83.3%(60/72) in saliva. Conclusion Peripheral blood mononuclear cel1s and epithelial cells of pharynx oralis are the important latent sites for EBV,HHV?6 and HHV?7. Co?infection of EBV with HHV?6 and HHV?7 exists in blood donors.
［KEY WORDS］ herpesvirus 4, human; herpesvirus 6, human; herpesvirus 7, human; blood transfusion
输血治疗是临床医学的重要手段之一，但输血并不是有益无害的治疗手段，也不是绝对安全的[1]。输血所致病毒感染一直为国内外输血界所关注，因此，与输血相关的病毒感染的危险性及检测病毒基因组的价值已成为医学领域中一个研究热点[2]。EB病毒（EBV）、人疱疹病毒6型（HHV?6）和7型（HHV?7）同属于人疱疹病毒科，原发感染后在宿主体内长期潜伏，可因输血或某些症状性疾病而激活，增加其再活动的危险度。大部分健康成人感染并携带EBV、HHV?6和HHV?7，病毒可持续存在于外周血细胞和唾液腺细胞中，而且唾液中可分泌具有感染性的病毒颗粒，对人体产生持久而稳定的感染。本研究采用PCR?Southern blotting检测109名健康无偿献血者外周血单个核细胞(PBMC)和唾液标本中EBV DNA，巢式 PCR(nested?PCR)技术结合限制性酶切分析检测其HHV?6和HHV?7 DNA，以调查献血员EBV、HHV?6和HHV?7的感染状况，分析其是否存在共感染及对输血的意义。
1 材料与方法
1.1 样本来源
随机采集青岛地区109名无偿献血者外周静脉血 10 mL (枸橼酸钠抗凝，比例1∶9)和唾液5 mL。109名献血者丙氨酸转氨酶（ALT）≤25 U(赖氏法)，HBsAg、抗?HCV、抗?HIV和梅毒螺旋体抗体均阴性，其他项目也均符合国家规定献血标准。
1.2 标本DNA的提取
枸橼酸钠抗凝血分离PBMC，唾液标本离心取沉淀，分别加入2 mL裂解缓冲液（含10 mmol/L Tris?HCl，150 mmol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，100 mg/L 蛋白酶K，1 g/L SDS），55 ℃消化2 h。采用酚?氯仿?异戊醇法常规提取细胞DNA，干燥后以TE缓冲液（pH 8.0）溶解，4 ℃保存备用。
1.3 EBV、HHV?6和HHV?7 DNA的检测
EBV特异性引物和探针参照文献[3]设计，上游引物序列为5′?CCAGACAGCAGCCAATTGTC?3′，下游引物序列为5′?GGTAGAAGACCCCCTCT?TAC?3′，探针序列为5′?CCCTGGTATAAAGTGGTCCTGCAGCTATTTCTGGTCGCATC?3′，扩增产物的长度为129 bp。PCR扩增的反应体系及Sou?thern boltting检测EBV DNA均参考文献[3]方法进行。巢式PCR扩增HHV?6 和HHV?7 DNA内外侧引物的设计和扩增条件分别参考文献[4?5]进行，HHV?6外侧扩增产物长度为287 bp，内侧扩增产物长度为163 bp；HHV?7外侧扩增产物长度为186 bp，内侧扩增产物长度为124 bp。
1.4 HHV?6限制性酶切分型和HHV?7鉴定
HHV?6酶切反应的体积为20 μL，包括10×buffer 2 μL，PCR扩增产物10 μL，限制性核酸内切酶Hind Ⅲ 10 U，去离子水补充体积至20 μL，混匀后瞬时离心，37 ℃水浴12～16 h。取酶切产物10 μL于120 g/L聚丙烯酰胺凝胶中80 V垂直电泳1 h，凝胶用EtBr （0.5 mg/L）染色20 min，紫外线透射仪下观察并记录电泳结果。HHV?6A可观察到66 bp和97 bp的条带，而HHV?6B未被消化，为163 bp的PCR扩增条带。HHV?7 PCR扩增产物采用限制性核酸内切酶EcoRⅠ进行酶切鉴定，反应条件和电泳条件同上，HHV?7特异性PCR扩增产物可观察到45 bp和79 bp的两条带。
2 结果
2.1 EBV DNA的PCR?Southern检测
本文109名献血者 PBMC中EBV DNA阳性23例，阳性率为21.10%；唾液标本中EBV DNA阳性27例，阳性率为24.77%；PBMC和唾液标本中均阳性者4例，合计阳性率42.2%（46/109）。见表1、2。部分标本PCR?Southern结果见图1。献血员EBV、HHV?6和HHV?7感染状况见表2。PBMC和唾液标本中EBV检出率差异无显著性(χ2=0.42，P>0.05)，而HHV?6和HHV?7在唾液标本中的检出率明显高于PBMC标本，差异有显著性（χ2=5.45、31.14，P<0.05、0.01）。
2.2 HHV?6 DNA检测结果和分型
109例献血员外周血PBMC中外侧PCR均未检测到HHV?6基因组，内侧PCR扩增有55例HHV?6 DNA阳性，阳性率为50.46%（55/109）；唾液标本中外侧PCR扩增有2例阳性，内侧PCR扩增有70例HHV?6 DNA阳性，阳性率为66.06%（72/109），PBMC和唾液标本均阳性者34例，合计阳性率85.32%（93/109），见表1、2。部分外周血PBMC标本和唾液标本HHV?6内侧PCR扩增结果见图2。PCR产物酶切分析显示，外周血PBMC HHV?6阳性的标本中，HHV?6A型占18.2%(10/55)，HHV?6B型占81.8%(45/55)；而在72例唾液HHV?6阳性的标本中，HHV?6A型占16.7%(12/72)，HHV?6B型占83.3%(60/72)，本文未观察到HHV?6A和HHV?6B均为阳性者。
2.3 HHV?7 DNA的检测与鉴定
本文109例献血员外周血PBMC中外侧PCR扩增有21例标本HHV?7 DNA阳性，内侧PCR扩增有42例HHV?7 DNA阳性，阳性率为57.80% (63/109)；在唾液标本中，外侧PCR扩增有85例HHV?7 DNA阳性，内侧PCR扩增有14例阳性，阳性率为 90.8%（99/109）；在PBMC和唾液标本中，HHV?7 DNA均阳性者共有63例，其合计阳性率为90.8%（99/109）。见表1、2。部分外周血PBMC和唾液标本HHV?7内侧PCR扩增结果见图3。表1 109例献血员PBMC和唾液标本中EBV、HHV?6和HHV?7检出率、表2 109例献血员PBMC和唾液标本中EBV、HHV?6和HHV?7感染情况（略）
2.4 EBV、HHV?6和HHV?7共感染状况
109名献血员外周血PBMC中EBV、HHV?6和HHV?7均阳性者7例，占6.4%；唾液中均阳性者17例，占15.6％。本文有58.7%的献血员同时感染HHV?6和HHV?7，而单独感染EBV的献血员较少，在外周血和唾液标本中分别只占2.75%和0.92%，唾液标本中仅有1名献血员3种病毒DNA检测均为阴性。见表3。表3 献血员血液、唾液EBV、HHV?6和HHV?7共感染状况分析（略）
3 讨论
EBV、HHV?6和HHV?7分别属人疱疹病毒科γ和β亚科成员，其原发感染通常发生在婴幼儿和儿童期，原发感染后可在体内形成潜伏感染，主要通过唾液传播，也可经输血传播。由于输血或外界原因导致机体免疫力下降或免疫功能抑制时潜伏感染状态的病毒可被激活，导致各种活动性感染。其靶细胞均为免疫细胞，EBV主要侵犯B淋巴细胞，过去认为只有B细胞表面有EBV受体，但进一步研究发现,在腮腺管、咽以及宫颈外的某些上皮细胞亦有EBV受体，因此EBV亦可以感染上皮细胞[6]。HHV?6和HHV?7二者有一定程度的同源性，主要感染CD4+T细胞，在大多数正常人CD4+Ｔ细胞中以潜伏感染的形式存在，病毒被激活后传播到其他细胞，而唾液腺中不断产生的病毒可造成低水平持续感染[7]。
本实验的结果显示，在109名献血员中EBV、HHV?6和HHV?7的检出率均较高，其中HHV?6存在着株差异性，HHV?6的A、B两个亚型广泛存在于健康成人及儿童PBMC和唾液中，但在不同疾病中的流行情况有所不同。HHV?6原发感染多为B亚型所致，在幼儿急疹和骨髓移植病人中主要为B亚型，而在艾滋病及淋巴增生性疾病病人中，A亚型的检出率则远高于B亚型。健康人群中HHV?6 B亚型毒株感染谱比A亚型广泛，本研究主要为HHV?6B型，其检出率为81.72%，与FOX等[9]报道的结果相似，说明B亚型毒株感染谱比A亚型更广泛。CUENDE等[10]应用巢式PCR检测献血员PBMC中HHV?6的阳性率为90%（18/20），其结果明显高于本研究HHV?6的检出率，推测健康成人HHV?6的感染率存在地区差异。青岛地区献血员PBMC中HHV?7检出率为57.8%，与WILBORN等[11]报道的PBMC中HHV?7的阳性检出率为66.1%（74/112）相似。另外，在部分献血员血细胞和唾液标本中均可以检测到EBV、HHV?6和HHV?7 DNA，表明3种病毒感染宿主后可以同时潜伏于唾液腺和PBMC中，并提示唾液和血液均可以传播病毒[9]。而且唾液中HHV?6和HHV?7的检出率明显高于PBMC，提示与血液比较唾液的传播可能具有更重要的意义。
此外，本研究结果显示，在健康献血员中存在EBV、HHV?6和HHV?7的共感染。EBV、HHV?6和HHV?7同属于人类疱疹病毒家族，在结构上有相似性，在发挥其生物学功能方面也有协同作用。有研究显示，在DIHS病人中存在EBV、HHV?6和HHV?7的共感染，血清学检测证实潜伏病毒可再活化，且HHV?6、HHV?7、CMV 和EBV再活化存在协同作用[12]。CHEN等[13]在研究人类疱疹病毒感染的解剖学图谱时证实，在所有的疱疹病毒中只有EBV、HHV?6和HHV?7在8例不同原因死者(其中2例死于HIV?AIDS)中同时表达，而且是多部位表达，进一步说明EBV、HHV?6和HHV?7存在共感染。
综上所述，健康献血员中EBV、HHV?6以及HHV?7的检出率较高，输注含有该病毒的血液可能增加受血者的机会性感染，特别是给器官移植病人或免疫功能低下病人带来危害。采取科学的输血方式，如输注去除白细胞制备的成分血，可以最大限度地减少病毒传播与感染引起的不良后果。探讨EBV、HHV?6和HHV?7对降低输血性疾病的危险性具有重要意义。
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